【技术实现步骤摘要】
产角鲨烯的裂殖壶菌基因工程菌株及其构建方法和应用
本专利技术属于遗传工程
,具体涉及裂殖壶菌基因工程菌株。
技术介绍
角鲨烯(Squalene)作为一种重要的萜类化合物,具有降血脂、防癌和抗氧化等功效,因此广泛应用于医疗保健领域。由于自然资源的限制和化学合成的困难,利用微生物发酵生产角鲨烯已经成为主要趋势。生物合成法具有易操作、周期短以及转化率高的优点,同时通过微生物发酵获得的产物易于分离纯化,具有良好的经济效益。生物合成法的技术重点是筛选出适合角鲨烯生产的并且具有经济价值的菌种。目前用于角鲨烯合成的菌种主要包括破囊壶菌、酵母、大肠杆菌和自养型微藻等。Nakazawa等人从海水中筛选出来的破囊壶菌18W-13a角鲨烯产量可以达到1.29g/L。Liu等人优化后的酿酒酵母角鲨烯产量达到11.00g/L,是目前已知基因工程菌株的最高产量。Li等从香港红树林中分离得到的自养型微藻AurantiochytriummangroveiFB1角鲨烯的产量极易受培养条件的影响,无法准确掌握角鲨烯产量最高的培养时间,产量仅有0.53mg ...
【技术保护点】
1.一种产角鲨烯的裂殖壶菌基因工程菌株,其特征在于:所述基因工程菌株选用Schizochytrium limacinum SR21为材料构建而成,所述基因工程菌株的基因组中elo1基因被敲除,同时pap基因被干扰表达。/n
【技术特征摘要】
1.一种产角鲨烯的裂殖壶菌基因工程菌株,其特征在于:所述基因工程菌株选用SchizochytriumlimacinumSR21为材料构建而成,所述基因工程菌株的基因组中elo1基因被敲除,同时pap基因被干扰表达。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌株,其特征在于:所述elo1基因和pap基因克隆于SchizochytriumlimacinumSR21的基因组。
3.一种权利要求1或2所述的基因工程菌株的构建方法,其特征在于:包括:
1)克隆来源于SchizochytriumlimacinumSR21基因组的elo1基因的上下游同源臂,插入pBlue-ZEO-18s质粒的同源重组区域,构建以博来霉素为抗性的elo1基因敲除载体pBlue-ZEO-elo1;
2)将来源于野生型菌株SchizochytriumlimacinumSR21基因组的pap基因的siRNA连接到真菌干扰质粒p-Silent-HYG的多克隆区域,利用PCR的方式扩增出潮霉素抗性表达框和siRNA的表达框;将该含有潮霉素抗性表达框和siRNA的表达框的片段整合进过表达质粒pBlue-ZEO-18s的多克隆区域,替换博来霉素表达框和过表达基因表达框,构建出以潮霉素为抗性,以18sRNA基因序列为同源臂的pap基因干扰载体pBlue-HYG-siRNA-18s;
3)将构建好的两载体同源重组区域线性化,电转入裂殖壶菌内,通过博来霉素和潮霉素抗性筛选和鉴定,获得elo1基因敲除结合pap基因干扰的所述产角鲨烯的裂殖壶菌基因工程菌株。
4.根据权利要求3所述的基因工程菌株的构建方法,其特征在于:所述步骤1)中,所述elo1基因上下游同源臂的构建方法包括:根据SchizochytriumlimacinumSR21基因组的elo1基因的序列信息,设计如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的上游同源臂扩增引物P1、如SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示的下游同源臂扩增引物P2;以SchizochytriumlimacinumSR21基因组为模版,用所述引物P1和所述引物P2通过PCR方式获得elo1基因上下游同源臂。
5.根据权利要求4所述的基因工程菌株的构建方法,其特征在于:所述步骤1)中,所述pBlue-ZEO-elo1的构建方法包括:用HindⅢ和KpnⅠ对pBlue-ZEO-18s和所述elo1基因上下游同源臂进行双酶切,连接,转化至大肠杆菌Trans110感受态细胞,获得所述pBlue-ZEO-elo1。
6.根据权利要求3所述的基因工程菌株的构建方法,其特征在于:所...
【专利技术属性】
技术研发人员:凌雪萍,郑鑫,卢英华,姚传义,陈翠雪,
申请(专利权)人:厦门大学,
类型:发明
国别省市:福建;35
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