一种用于检测STAT3二聚化的质粒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测STAT3二聚化的质粒，属于分子生物学技术领域。本发明专利技术的质粒包括如下3种片段：(1)启动子；(2)第一个STAT3基因，其5’端与标签蛋白A的序列相连；(3)第二个STAT3基因，其3’端与标签蛋白B的序列相连；其中，(1)和(2)通过2A肽的基因相连；所述标签蛋白A和标签蛋白B序列不同。本发明专利技术的质粒在细胞中可1∶1的翻译出带有不同标签的STAT3蛋白，通过其中一个标签纯化蛋白后，再针对另一标签进行检测，即可客观反映STAT3二聚化水平。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测STAT3二聚化的质粒
本专利技术属于分子生物学

技术介绍
信号转导和转录激活因子3(signaltransducerandactivatoroftranscription3，STAT3)是具有转录活性的癌基因，其单体首先在胞浆中磷酸化，随后磷酸化的STAT3单体二聚化形成二聚体，变成有活性的STAT3。活化的STAT3二聚体向细胞核移位进而调控肿瘤的增殖、生存、转移、血管生成、免疫应答等过程。STAT3二聚体已经成为抗肿瘤新药筛选的重要靶标之一，研究表明，G-四联体寡核苷酸类(G-quartetoligo-nucleotides)可形成一个复杂的三级结构抑制STAT3的二聚化，从而在体外和小鼠模型中抑制鳞癌的生长(刘俊等.STAT3信号通路及其肿瘤分子靶向治疗的研究进展.中国神经精神疾病杂志，2011年第37卷第7期)。为了提高这类抑制STAT3二聚化的药物的筛选效率，需要建立相关的细胞模型，来反映药物的抑制STAT3二聚化的能力。陈俊生等分别构建pECFP-N1-STAT3和pEYFP-N1-STAT3的荧光报告载体，利用脂质体转染技术将二者共转入HEK-293T细胞，利用ECFP(作为供体分子)和EYFP(作为受体分子)两种荧光蛋白之间能量共振转移，检测STAT3分子的二聚化水平(陈俊生等.基于荧光共振能量转移技术的STAT3二聚化抑制剂筛选模型的建立.中国海洋药物，2018年37卷第3期)。但是，该方法需要构建2种载体，共转入细胞后两种载体的数量很难保持一致，那么二聚体形成可能因为其中一种载体数量不足而受到抑制，导致假阳性。此外，虽然非变性聚丙酰胺凝胶电泳结合免疫印迹可检测蛋白多聚体，但存在检测敏感度低，实验条件不易控制等问题。
技术实现思路
本专利技术要解决的问题是：提供一种用于检测STAT3二聚化的质粒，以及检测STAT3二聚化的方法。本专利技术的技术方案如下：一种用于检测STAT3二聚化的质粒，所述质粒包括如下3种片段：(1)启动子；(2)第一个STAT3基因，其5’端与标签蛋白A的序列相连；(3)第二个STAT3基因，其3’端与标签蛋白B的序列相连；其中，(2)和(3)通过2A肽相连；所述2A肽又叫2A自剪切肽，是一类长18-22个氨基酸残基的肽片段，能诱导细胞内含有2A肽的重组蛋白自我剪切。这种肽都有一段序列模体，经常会在最后甘氨酸(G)和脯氨酸(P)连接处导致核糖体无法连接，翻译蛋白时提前终止，从而造成“剪切”的效果。所述标签蛋白A和标签蛋白B序列不同；质粒中，片段(1)～(3)按照(1)-(2)-(3)或(1)-(3)-(2)的顺序排列。进一步地，所述标签蛋白A为FLAG标签，所述标签蛋白B为Myc标签；或，所述标签蛋白A为Myc标签，所述标签蛋白B为FLAG标签。进一步地，所述质粒是以pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP-T2A-Puro载体为空载体骨架，于多克隆位点插入片段(1)～(3)得到的质粒。前述质粒的制备方法，包括如下步骤：1)使用序列如SEQIDNO.1～2所述引物对STAT3的cDNA进行PCR扩增，得到Flag-STAT3片段；2)将Flag-STAT3插入空载体骨架，得pCDH-CMV-Flag-Stat3-GFP-Puro；3)使用序列如SEQIDNO.6～7所述的引物对STAT3的eDNA进行PCR扩增，得到Myc-STAT3-T2A片段；4)将Myc-STAT3-T2A片段通过NheI酶切后插入pCDH-CMV-Flag-Stat3-GFP-Puro，即得。进一步地，步骤2)为：Flag-STAT3片段、空载体骨架通过NheI、NotI酶切后，通过T4连接酶连接。进一步地，步骤4)为：pCDH-CMV-Flag-Stat3-GFP-Puro通过NheI酶切后，通过同源重组，将其与Myc-STAT3-T2A片段连接成环。一种检测细胞内STAT3二聚化水平的方法，包括：a)将权利要求1～3任一所述质粒转染至细胞；b)根据标签蛋白A分离蛋白；c)以分离的蛋白为样品，对标签蛋白B进行检测。进一步地，步骤b)的分离为使用免疫沉淀方法进行分离。进一步地，步骤c)的检测为使用Westernblot检测。前述质粒在用于筛选STAT3二聚化抑制剂中的用途。本专利技术的有益效果：本专利技术的质粒在细胞中可1∶1地翻译出带有不同标签的STAT3蛋白，若形成STAT3二聚体，则二聚体同时带有两种不同的标签(如图1)。通过其中一个标签纯化蛋白后，再针对另一标签进行检测，即可客观反映STAT3二聚化水平。显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。附图说明图1：带有不同标签的STAT3二聚体示意图。图2：pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP-T2A-Puro载体结构示意图。图3：pCDH-CMV-Flag-Stat3-GFP-Puro质粒示意图。图4：pCDH-CMV-Myc-STAT3-T2A-Flag-STAT3-GFP-Puro质粒示意图。图5：Flag-STAT3的PCR产物条带。左起第一泳道为DL15000DNAMarker(从上到下为15000、10000、7500、5000、2500、1000、250bp)，第二泳道为目标条带，第三泳道为Spark2000DNAMarker(从上到下为2000、1000、750、500、250、100bp)。图6：Flag抗体免疫印迹(IB)检测结果和Myc抗体免疫共沉淀(IP)后再进行Flag免疫印迹检测的结果。图7：Myc抗体免疫印迹(IB)检测结果和Flag抗体免疫共沉淀(IP)后再进行Myc免疫印迹检测的结果。具体实施方式实施例1本专利技术质粒的构建构建过程为：使用pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP-T2A-Puro为空载体骨架(lifescience-market，香港)(如图2所示)，在其多克隆位点(MCS)，通过双酶切，插入Flag-STAT3片段，得到pCDH-CMV-Flag-Stat3-GFP-Puro(如图3所示)；在pCDH-CMV-Flag-Stat3-GFP-Puro的基础上，在Flag-STAT3片段的上游相邻位置插入Myc-STAT3-T2A片段，得到本专利技术的质粒pCDH-CMV-Myc-STAT3-T2A-Flag-STAT3-GFP-Puro(如图4所示)。T2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测STAT3二聚化的质粒，其特征在于：所述质粒包括如下3种片段：/n(1)启动子；/n(2)第一个STAT3基因，其5’端与标签蛋白A的序列相连；/n(3)第二个STAT3基因，其3’端与标签蛋白B的序列相连；/n其中，(2)和(3)通过2A肽相连；/n所述标签蛋白A和标签蛋白B序列不同；/n质粒中，片段(1)～(3)按照(1)-(2)-(3)或(1)-(3)-(2)的顺序排列。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测STAT3二聚化的质粒，其特征在于：所述质粒包括如下3种片段：
(1)启动子；
(2)第一个STAT3基因，其5’端与标签蛋白A的序列相连；
(3)第二个STAT3基因，其3’端与标签蛋白B的序列相连；
其中，(2)和(3)通过2A肽相连；
所述标签蛋白A和标签蛋白B序列不同；
质粒中，片段(1)～(3)按照(1)-(2)-(3)或(1)-(3)-(2)的顺序排列。


2.如权利要求1所述的质粒，其特征在于：所述标签蛋白A为FLAG标签，所述标签蛋白B为Myc标签；
或，所述标签蛋白A为Myc标签，所述标签蛋白B为FLAG标签。


3.如权利要求1所述的质粒，其特征在于：所述质粒是以pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP-T2A-Puro载体为空载体骨架，于多克隆位点插入片段(1)～(3)得到的质粒。


4.权利要求3所述质粒的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)使用序列如SEQIDNO.1～2所述引物对STAT3的cDNA进行PCR扩增，得到Flag-STAT3片段；
2)将Flag-STAT3插入空载体骨架，得pCDH-CMV-Flag-Stat3-GFP-Puro；
3)使用序列如S...

【专利技术属性】
技术研发人员：王紫静，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：四川;51