一种基于H-rGO-Pt@Pd NPs纳米酶可视化检测GPC3的方法技术

一种基于H‑rGO‑Pt@Pd NPs纳米酶可视化检测GPC3的方法，以H‑rGO‑Pt@Pd NPs‑Apt为检测探针，GPC3‑Ab为捕获探针，形成H‑rGO‑Pt@Pd NPs‑Apt/GPC3/Ab夹心型复合物，基于H‑rGO‑Pt@Pd NPs纳米酶的类过氧化氢酶催化活性，该复合物催化H

【技术实现步骤摘要】
一种基于H-rGO-Pt@PdNPs纳米酶可视化检测GPC3的方法
本专利技术属于生物检测领域，具体涉及一种基于复合纳米酶材料可视化检测GPC3的方法。
技术介绍
磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（GPC3）是近年来发现的一种新型肝癌标志物，常用的检测方法有：酶联免疫吸附测定法（ELISA），电化学免疫分析法，荧光检测法和免疫组织化学法等方法。公开号CN112014577A的专利技术专利，涉及一种磁珠微粒偶联鼠抗人GPC3单克隆抗体与碱性磷酸酶标记兔抗人GPC3多克隆抗体检测GPC3的试剂盒，该方法的操作过程比较复杂，试剂盒成本较高。公开号CN105759051B的专利技术专利，涉及一种以吖啶酯为发光标物的GPC3纳米磁微球化学发光免疫分析测定GPC3的试剂盒，该方法所用仪器昂贵，对操作技能有较高的要求。因此，需要建立一种快速、操作简便的GPC3检测方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种基于血红素-还原氧化石墨烯-铂@钯（H-rGO-Pt@PdNPs）纳米酶构建检测体系，采用分光光度法可视化检测GPC3的方法。为了解决该技术问题，采用一步还原法制备H-rGO-Pt@PdNPs纳米酶，利用纳米酶与GPC3适配体（GPC3-Apt）的π-π共轭作用，形成H-rGO-Pt@PdNPs-Apt检测探针，以GPC3抗体（GPC3-Ab）作为捕获探针，捕获GPC3蛋白，从而形成适配体-蛋白-抗体夹心型复合物。利用H-rGO-Pt@PdNPs的类过氧化物酶的催化性质，催化过氧化氢（H2O2）氧化显色底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）为TMBOX，使得体系溶液由无色变成蓝色。随着GPC3浓度的增加，体系的蓝色会越来越深，从而实现GPC3的可视化检测。本专利技术按照以下步骤进行：步骤1：H-rGO-Pt@PdNPs纳米酶的制备（1）还原性氧化石墨烯（rGO）的制备：称取氧化石墨烯（GO）置于超纯水中，破碎。加入抗坏血酸（AA），搅拌，得rGO溶液。（2）血红素-还原氧化石墨烯（H-rGO）的制备：称取血红素，用氨水和超纯水溶解，加入rGO溶液，再加入水合肼溶液，搅拌均匀后恒温水浴，离心洗涤，即得H-rGO纳米材料。（2）H-rGO-Pt@PdNPs纳米酶的制备：向H-rGO溶液中加入聚二烯丙基二甲基氯化铵（PDDA）溶液和氯化钠（NaCl）溶液，搅拌混匀，离心洗涤得到PDDA修饰的H-rGO溶液。将氯钯酸钠（Na2PtCl6）和氯铂酸钠（Na2PdCl4）溶液加入到PDDA修饰的H-rGO溶液中，搅拌反应。向溶液中加入乙二醇溶液还原，用NaOH溶液调节pH值，恒温水浴后，离心洗涤，即得H-rGO-Pt@PdNPs纳米酶。步骤2：H-rGO-Pt@PdNPs-Apt检测探针的制备取GPC3-Apt与H-rGO-Pt@PdNPs溶液混匀孵育，离心洗涤，即得H-rGO-Pt@PdNPs-Apt检测探针。步骤3：GPC3可视化检测体系的构建将GPC3-Ab滴加到试管内，加入BSA溶液对非特异性结合位点进行封闭，在封闭后的试管中加入不同浓度待检测的GPC3蛋白溶液，一段时间以后将H-rGO-Pt@PdNPs-Apt加入试管中，在上述试管中加入显色底物体系TMB-H2O2，反应一段时间，形成GPC3可视化检测体系。对上述体系进行H-rGO-Pt@PdNPs-Apt浓度、孵育温度、孵育时间、检测体系的pH值和离子强度等实验条件优化，获得最佳的GPC3可视化检测体系。步骤4：GPC3的工作曲线绘制在步骤3得到的最佳GPC3可视化检测体系中，获取不同浓度待检测的GPC3蛋白溶液的波长为500～800nm的紫外-可见吸收曲线，记录其最大吸收峰652nm处的吸光度。根据吸光度和GPC3蛋白浓度的关系，绘制工作曲线，计算检测限。步骤5：实际血清样本中GPC3的检测将已知浓度的GPC3蛋白和实际人血清样本混合，添加到根据步骤3得到的最佳GPC3可视化检测体系中，记录652nm处的吸光度值。采用紫外-可见分光光度计进行波长扫描，记录其在652nm处的吸光度。利用步骤3所得到的GPC3工作曲线，计算得出实际能够检测的GPC3浓度。其中，步骤1为GPC3的可视化检测提供一种具有高效类过氧化氢酶催化活性的纳米酶材料；步骤2为GPC3的可视化检测提供了一种能够特异性识别GPC3蛋白的检测探针。步骤3为GPC3的可视化测定提供了可行性条件。步骤4的GPC3的工作曲线为步骤5的实际血清样本中GPC3浓度的测定提供计算依据。可见步骤1-5相互支撑，共同作用，才能利用H-rGO-Pt@PdNPs纳米酶实现GPC3的可视化检测。本专利技术与现有技术相比具有如下优点：1、本专利形成的H-rGO-Pt@PdNPs纳米酶独特的网状结构以及较大的比表面积增强了对GPC3-Apt的吸附效率，进一步增强了与GPC3的特异性结合，提高了对GPC3的检测效率。此外，rGO的高比表面积、Hemin的过氧化物酶性质以及金属Pt@PdNPs的优异催化性能，三者的协同效应提高了H-rGO-Pt@PdNPs纳米酶的催化性能，使得检测更加灵敏，检测限可达1.801ng/mL。、该体系采用以H-rGO-Pt@PdNPs-GPC3-Apt为检测探针、GPC3-Ab为捕获探针，利用GPC3-Apt、GPC3-Ab与靶标GPC3之间的较强亲和力，构建了适配体-靶标-抗体夹心型结构。该结构能够更加牢固的固定靶标分子，使得靶标分子不易于脱落，从而更加有利于靶标分子的检测。此外，利用该纳米酶所构建的检测体系不仅可以检测GPC3分子，而且可以通过改变抗体和适配体结构，用于检测如甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）等其它靶标分子。附图说明图1基于H-rGO-Pt@PdNPs的可视化检测GPC3的原理图；图2H-rGO（A）、H-rGO-Pt@PdNPs（B）的扫描电镜（SEM）图；图3H-rGO-Pt@PdNPs-Apt检测探针的紫外-可见吸收光谱（UV-vis）图；图4不同浓度GPC3的工作曲线。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术进行详细说明。一种基于H-rGO-Pt@PdNPs纳米酶的可视化检测GPC3的方法，检测原理如图1所示。通过一步还原法制备具有类过氧化物酶催化活性的H-rGO-Pt@PdNPs纳米酶，利用纳米酶与GPC3适配体（GPC3-Apt）的π-π共轭作用，形成H-rGO-Pt@PdNPs-Apt检测探针，并在试管中固定GPC3-Ab作为捕获探针，当有目标靶标GPC3蛋白存在时，通过GPC3-Apt、GPC3-Ab分别与GPC3蛋白的特异性识别而结合，从而形成H-rGO-Pt@PdNPs-Apt/GPC3/GPC3-Ab夹心型复合物，该复合物催化H2O2氧化显色底物TMB，使得体系溶液由无色变成蓝色。随着GPC3浓度的增加，体系的蓝色会越来越深，从而实现GPC3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种H-rGO-Pt@Pd NPs纳米酶的制备方法，按以下步骤进行：/n（1） H-rGO的制备/n将rGO与Hemin混合，水浴，离心、洗涤，得到H-rGO纳米复合材料；/n其特征在于：还包括/n（2）H-rGO-Pt@Pd NPs纳米酶的制备/n① 往H-rGO溶液中加入PDDA溶液和NaCl溶液，搅拌反应；离心、洗涤，得到被PDDA修饰的H-rGO复合纳米材料；/n② 将Na

【技术特征摘要】
1.一种H-rGO-Pt@PdNPs纳米酶的制备方法，按以下步骤进行：
（1）H-rGO的制备
将rGO与Hemin混合，水浴，离心、洗涤，得到H-rGO纳米复合材料；
其特征在于：还包括
（2）H-rGO-Pt@PdNPs纳米酶的制备
①往H-rGO溶液中加入PDDA溶液和NaCl溶液，搅拌反应；离心、洗涤，得到被PDDA修饰的H-rGO复合纳米材料；
②将Na2PtCl6和Na2PdCl4溶液加入被PDDA修饰的H-rGO复合纳米材料，搅拌反应；加入乙二醇溶液和NaOH溶液调节pH值，恒温水浴；离心、洗涤，即得H-rGO-Pt@PdNPs纳米酶。


2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1中所述rGO与Hemin混合体积比为1:（1-4）。


3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1中所述的用于H-rGO修饰的PDDA为2.0mL0.2%，NaCl为5.0mL0.2mol/L。


4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1中所述的采用NaOH调节的pH值为11-13。


5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1中所述的Na2PtCl6和Na2PdCl4均为2.0mL20mmol/L。


6.基于权利要求1所得H-rGO-Pt@PdNPs纳米酶用于可视化检测GPC3的方法，其特征在于，采用如下步骤：
步骤1：H-rGO-Pt@PdNPs-Apt检测探针的制备
取GPC3-Apt和H-rGO-Pt@PdNPs溶液超声混合，将混合液室温孵育，离心洗涤，得H-rGO-Pt@PdNPs-Apt检测探针；
步骤2：GPC3可视化检测体系的构建
将捕获探针GPC3-Ab滴加到试管内，加入BSA溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：李桂银，陈敏，何利翁，王博，周治德，
申请(专利权)人：桂林电子科技大学，
类型：发明
国别省市：广西;45