一种Cpf1蛋白及基因编辑系统技术方案

本发明专利技术涉及一种Cpf1蛋白及基因编辑系统，其包含Cpf1蛋白或者编码所述Cpf1蛋白的一种或多种多核苷酸，以及CRISPR RNA或一种或多种编码该CRISPR RNA的多核苷酸；其中，所述Cpf1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或与SEQ ID NO.1具有至少80％的同源性的序列。本发明专利技术通过对宏基因组生物信息学分析，挖掘出一种新的2型CRSIPR/Cas基因编辑系统，该基因编辑系统应用于编辑原核生物或真核生物基因，为基因编辑工具箱提供了新选择。本发明专利技术提供一种新的V型CRISPR/Cas12a基因编辑系统，该基因编辑系统具有新理化性质且可以识别多种不同的PAM序列(TTNA)。

【技术实现步骤摘要】
一种Cpf1蛋白及基因编辑系统
本专利技术属于基因编辑
，具体涉及一种Cpf1蛋白及基因编辑系统。
技术介绍
基因编辑(geneediting)技术使得DNA序列定位点进行改造成为可能，比如第一代基因编辑工具锌指核酸酶(zincfingernucleases,ZFNs)，第二代基因编辑工具类似转录激活的小型核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornucleases,TALENs)都可以用于改造靶向基因组，但是这些方法设计困难，不易制作，成本昂贵且普适性不强。CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复序列，ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeat)/Cas(CRISPR-associatedprotein)系统，是来自古生菌和细菌的天然免疫系统，为第三代基因编辑工具，其不同于以往基因编辑工具(蛋白质-DNA识别)，利用核酸碱基互补配对原理进行目标DNA序列的识别，引导Cas效应蛋白进行定点切割，适用性强、设计简单、成本低、效率高。Cas蛋白包含多种不同的效应结构域(domain)，在核酸识别、稳定复合物结构、水解DNA磷酸二酯键等不同的活动中发挥作用。其中，源自化脓链球菌(StreptococcuspyogeneCas9，SpCas9)的II型CRISPR/Cas系统因其切割效率高，成为现下应用最为广泛的CRISPR/Cas系统。这一系统通过识别并切割靶向的多核苷酸上的原间隔序列临近模块(ProtospacerAdjacentMotif,PAM)序列，即“NGG”，从而留下一个平末端突出端并且影响基因编辑。近年来被归为V型的包含Cpf1的II型CRISPR也逐渐被广泛地应用于基因编辑领域，与Cas9核酸内切酶不同的是，Cpf1蛋白的切割只需要单条RNA引导，此功能可以简化基因编辑工具的设计与使用。同时，Cpf1这一系统通过识别富含T的PAM并且在其靶向DNA序列留下粘性末端从而产生基因编辑的效果，Cpf1家族蛋白识别PAM的T/C偏好性扩展了CRISPR靶向编辑核酸的范围。在庞大以及各色各样的宏基因组中，隐藏了尚未培养甚至尚未发现的微生物，可能存在大量的未被发现的CRISPR/Cas系统，这些系统在原核生物和真核生物，以及在体外环境中的活性也需要得到证实。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新的基因编辑系统以丰富现有的基因编辑工具家族。为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案是：本专利技术第一方面提供一种Cpf1蛋白，所述Cpf1蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，或与其具有至少80％的同源性。优选地，所述的Cpf1蛋白的氨基酸序列与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列具有至少85％的同源性，优选具有至少90％的同源性，进一步优选具有至少95％的同源性，再优选至少具有96％、97％、98％、99％的同源性。优选地，所述Cpf1蛋白包含以下位置处的一个或多个突变型氨基酸残基：位置117、150、267、281、538、593、776。该Cpf1蛋白为DNA核酸内切酶，所述Cpf1蛋白通过不同的核酸酶结构域在PAM序列的下游切割与CRISPRRNA(crRNA)互补的双链DNA；所述不同的核酸酶结构域为HNH样核酸酶结构域或RuvC样核酸酶结构域。本专利技术所述的Cpf1蛋白简称为LtCpf1，其包含1296个氨基酸，是一种多功能DNA多结构域核酸内切酶。它同时具有RNA和DNA内切酶活性，参与pre-crRNA的成熟，以及通过一个RuvC核酸酶结构域和一个HNH样核酸酶结构域识别并有效切割PAM的下游与crRNA互补的双链DNA，切割PAM序列下游靶向DNA链的第23位和非靶向DNA链的第17位核苷酸，产生6个核苷酸突出的粘性末端。本专利技术的第二方面提供一种多核苷酸，所述多核苷酸编码上述Cpf1蛋白。优选地，所述多核苷酸经密码子优化用于在目的细胞中的表达。本专利技术的第三方面是提供一种载体，所述载体包含上述多核苷酸。本专利技术的第四方面是提供一种载体系统，其包含一种或多种载体，所述一种或多种载体包含上述多核苷酸，并且在相同或不同的载体上包含编码CRISPRRNA的一种或多种多核苷酸。本专利技术的第五方面是提供一种复合物，所述复合物包含所述的Cpf1蛋白，以及CRISPRRNA。本专利技术的第六方面是提供一种V型CRISPR/Cas12a基因编辑系统，其包含所述的Cpf1蛋白或者编码所述Cpf1蛋白的一种或多种核苷酸序列，以及CRISPRRNA的一种或多种编码该CRISPRRNA的多核苷酸序列。优选地，所述V型CRISPR/Cas12a基因编辑系统还包括辅助蛋白或编码所述辅助蛋白的一种或多种多核苷酸，所述辅助蛋白可以参与外源基因的捕获。进一步优选地，所述的辅助蛋白包括Cas1蛋白、Cas2蛋白和Cas4蛋白中的一种或多种。进一步优选地，所述Cas1蛋白具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列，或与SEQIDNO:2所示的氨基酸序列至少80％同源性的氨基酸序列，优选具有至少85％的同源性，进一步优选具有至少90％的同源性，更优选具有至少95％的同源性，再优选具有至少96％、97％、98％、99％的同源性；所述Cas2蛋白具有SEQIDNO:3所示的氨基酸序列，或与SEQIDNO:3所示的氨基酸序列至少80％同源性的氨基酸序列，优选具有至少85％的同源性，进一步优选具有至少90％的同源性，更优选具有至少95％的同源性，再优选具有至少96％、97％、98％、99％的同源性；所述Cas4蛋白具有SEQIDNO:4所示的氨基酸序列，或与SEQIDNO:4所示的氨基酸序列至少80％同源性的氨基酸序列，优选具有至少85％的同源性，进一步优选具有至少90％的同源性，更优选具有至少95％的同源性，再优选具有至少96％、97％、98％、99％的同源性。本专利技术的第七方面还提供一种CRISPRRNA的设计原则，包括以下一种或多种：a)CRISPRRNA的序列格式为：5’-与Cpf1蛋白结合的直接重复序列-与靶序列互补的间隔序列-3’；b)CRISPRRNA的间隔序列长度为10-30个碱基序列；c)CRISPRRNA的直接重复序列长度为12-37个碱基序列；d)CRISPRRNA的直接重复序列应包含茎环结构。具体地，所述的靶序列为外源DNA片段或针对目的基因设计并人工合成的靶序列。优选地，所述的CRISPRRNA的直接重复序列如SEQIDNO:5所示，或与其具有至少80％同源性，更优选地，所述的直接重复序列如SEQIDNO:6至12中的任一序列所示，或与SEQIDNO:6至12中的任一序列具有至少80％同源性，优选具有至少85％的同源性，更优选具有至少90％的同源性，再优选具有至少95％的同源性，再进一步优选具有至少96％、97％、98％、99％的同源性。优选地，所述的CRISPRR本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种V型CRISPR/Cas 12a基因编辑系统，其特征在于：其包含Cpf1蛋白或者编码所述Cpf1蛋白的一种或多种多核苷酸，以及CRISPR RNA或一种或多种编码该CRISPR RNA的多核苷酸；其中，所述Cpf1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或与SEQ ID NO.1具有至少80％的同源性的序列，优选具有至少85％的同源性，优选具有至少90％的同源性，进一步优选具有至少95％的同源性，再优选至少具有96％、97％、98％、99％的同源性。/n

【技术特征摘要】
20201020 CN 20201112307311.一种V型CRISPR/Cas12a基因编辑系统，其特征在于：其包含Cpf1蛋白或者编码所述Cpf1蛋白的一种或多种多核苷酸，以及CRISPRRNA或一种或多种编码该CRISPRRNA的多核苷酸；其中，所述Cpf1蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，或与SEQIDNO.1具有至少80％的同源性的序列，优选具有至少85％的同源性，优选具有至少90％的同源性，进一步优选具有至少95％的同源性，再优选至少具有96％、97％、98％、99％的同源性。


2.根据权利要求1所述的V型CRISPR/Cas12a基因编辑系统，其特征在于：所述Cpf1蛋白包含以下位置处的一个或多个突变型氨基酸残基：位置117、150、267、281、538、593、776。


3.根据权利要求1所述的V型CRISPR/Cas12a基因编辑系统，其特征在于：所述Cpf1蛋白为DNA核酸内切酶，所述Cpf1蛋白通过不同的核酸酶结构域在PAM序列的下游切割与CRISPRRNA互补的双链DNA；所述不同的核酸酶结构域为HNH样核酸酶结构域或RuvC样核酸酶结构域；所述PAM序列为TTNA，其中N为A、T、C、G。


4.根据权利要求1所述的V型CRISPR/Cas12a基因编辑系统，其特征在于：所述的CRISPRRNA设计原则包括以下一种或多种：
1)CRISPRRNA的序列格式为：5’-与Cpf1蛋白结合的直接重复序列-与靶序列互补的间隔序列-3’；
2)CRISPRRNA的间隔序列长度为10-30个碱基序列；
3)CRISPRRNA的直接重复序列长度为12-37个碱基序列；
4)CRISPRRNA的直接重复序列应包含茎环结构。


5.根据权利要求4所述的V型CRISPR/Cas12a基因编辑系统，其特征在于：所述CRISPRRNA的直接重复序列如SEQIDNO:5所示，或与其具有至少80％同源性，优选如SEQIDNO:6至12中的任一序列所示，或与SEQIDNO:6至12中的任一序列具有至少80％同源性。


6.根据权利要求1至5中任一项所述的V型CRISPR/Cas12a基因编辑系统，其特征在于：所述的CRISPRRNA由CRISPRArray转录生成，所述的CRISPRArray包括直接重复序列以及间隔序列，所述的CRISPRArray的间隔序列包括靶序列以及与Cpf1蛋白相关的元件，
所述与Cpf1蛋白相关的元件的的核苷酸序列如SEQIDNO:13，或与其具有至少80％同源性，和/或，
如SEQIDNO:14...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢红娴，程欢欢，黄龙，兰凯，
申请(专利权)人：珠海舒桐医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44