用CAS12A蛋白进行基因组工程的组合物和方法技术

本公开提供了切割靶核酸的新颖Cas12a蛋白及其使用方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用CAS12A蛋白进行基因组工程的组合物和方法交叉引用本申请要求于2018年8月9日提交的韩国专利申请10-2018-0093336和2018年10月30日提交的美国临时申请号62/752,950的优先权和权益，每件所述申请的全部内容通过引用并入本文中。
技术介绍
基因组编辑是一种基因工程技术，其靶向将基因插入基因组的特定位置，从而修饰缺陷基因和/或引入功能基因。使用RNA指导的内切核酸酶切割关注的核酸序列的成簇规律间隔短回文重复(CRISPR)-CRISPR相关(Cas)技术的最新进展进一步提高了效率并缩短了基因组编辑过程。但是，当前使用传统内切核酸酶的CRISPR技术苦于精度相对较低。因此，仍然非常需要新颖高效的内切核酸酶。
技术实现思路
本公开提供了一种组合物，其包含i)-iv)中的至少一种，以及与i)-iv)中的所述至少一种偶联的指导RNA：i)与SEQIDNO:1的残基829至残基991具有至少80％序列一致性的多肽，其中所述多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQIDNO:1的位置925处的赖氨酸对齐的赖氨酸；ii)与SEQIDNO:3的残基825至残基996具有至少80％序列一致性的多肽，其中所述多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQIDNO:3的位置930处的赖氨酸对齐的赖氨酸；iii)与SEQIDNO:1具有至少80％序列一致性的多肽，其中所述多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQIDNO:1的位置925处的赖氨酸对齐的赖氨酸；或iv)与SEQIDNO:3具有至少80％序列一致性的多肽，其中所述多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQIDNO:3的位置930处的赖氨酸对齐的赖氨酸。指导RNA包含与包含6至60个碱基的真核核酸序列反向互补的序列。在一些实施方案中，相对于SEQIDNO:1或SEQIDNO:1，在最佳比对时，与SEQIDNO:1的位置925处的赖氨酸对齐的赖氨酸或与在SEQIDNO:3的位置930处的赖氨酸对齐的赖氨酸可以分别不在位置925或930处。在一些实施方案中，真核核酸序列是人核酸序列，其可以包含处于KRAS、HER2/neu、PD-1、TCR、p53、CCR5、DNMT1、EMX1和LKB1中的区域。可替代地和/或另外地，真核核酸序列是植物核酸序列。优选地，多肽是V型CRISPR相关蛋白。在这样的实施方案中，优选地，V型CRISPR相关蛋白是Cas12a蛋白。在一些实施方案中，多肽包含纯化标签。纯化标签包含选自由以下组成的组中的至少一种标签：His标签、FLAG标签、AU1表位标签、AU5表位标签、噬菌体T7标签、噬菌体V5表位标签、蓝舌病毒标签(B标签)、Glu-Glu标签(EE标签)、HSV表位标签、KT3表位标签、Myc表位标签、PDZ配体标签、聚精氨酸标签、聚天冬氨酸标签、聚半胱氨酸标签、聚苯丙氨酸标签、蛋白C标签、S1标签、S标签、Step标签和VSV-G标签。在一些实施方案中，指导RNA包含富含A的原间隔子相邻基序(protospaceradjacentmotif，PAM)序列、富含G的PAM序列、富含T的PAM序列或富含C的PAM序列。任选地，PAM序列包含3个T核碱基、2个T核碱基、1个T核碱基或TTTN。可替代地和/或另外地，指导RNA包括crRNA和tracrRNA。优选的是，与AsCas12a、FnCas12a或LbCas12a相比，组合物显示出至少2倍增高的基因组编辑效率。在一些实施方案中，组合物还包含赋形剂。在一些实施方案中，赋形剂具有7至8的pH。在一些实施方案中，赋形剂是缓冲液，其可以包含Bis-Tris丙烷-HCl、MgCl2或牛血清白蛋白中的至少一种。本公开还公开了一种基因编辑的方法，其包括：提供一种组合物，所述组合物包含i)-iv)中的至少一种，以及与i)-iv)中的所述至少一种偶联的指导RNA：i)与SEQIDNO:1的残基829至残基991具有至少80％序列一致性的多肽，其中所述多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQIDNO:1的位置925处的赖氨酸对齐的赖氨酸；ii)与SEQIDNO:3的残基825至残基996具有至少80％序列一致性的多肽，其中所述多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQIDNO:3的位置930处的赖氨酸对齐的赖氨酸；iii)与SEQIDNO:1具有至少80％序列一致性的多肽，其中所述多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQIDNO:1的位置925处的赖氨酸对齐的赖氨酸；或iv)与SEQIDNO:3具有至少80％序列一致性的多肽，其中所述多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQIDNO:3的位置930处的赖氨酸对齐的赖氨酸。指导RNA包含与包含6至60个碱基的真核核酸序列反向互补的序列。在一些实施方案中，真核核酸序列是人核酸序列，其可以包含处于KRAS、HER2/neu、PD-1、TCR、p53、CCR5、DNMT1、EMX1和LKB1中的区域。可替代地和/或另外地，真核核酸序列是植物核酸序列。优选地，多肽是V型CRISPR相关蛋白。在这样的实施方案中，优选地，V型CRISPR相关蛋白是Cas12a蛋白。在一些实施方案中，多肽包含纯化标签。纯化标签包含选自由以下组成的组中的至少一种标签：His标签、FLAG标签、AU1表位标签、AU5表位标签、噬菌体T7标签、噬菌体V5表位标签、蓝舌病毒标签(B标签)、Glu-Glu标签(EE标签)、HSV表位标签、KT3表位标签、Myc表位标签、PDZ配体标签、聚精氨酸标签、聚天冬氨酸标签、聚半胱氨酸标签、聚苯丙氨酸标签、蛋白C标签、S1标签、S标签、Step标签和VSV-G标签。在一些实施方案中，指导RNA包含富含A的原间隔子相邻基序(PAM)序列、富含G的PAM序列、富含T的PAM序列或富含C的PAM序列。任选地，PAM序列包含3个T核碱基、2个T核碱基、1个T核碱基或TTTN。可替代地和/或另外地，指导RNA包括crRNA和tracrRNA。在一些实施方案中，组合物还包含赋形剂。在一些实施方案中，赋形剂具有7至8的pH。在一些实施方案中，赋形剂是缓冲液，其可以包含Bis-Tris丙烷-HCl、MgCl2或牛血清白蛋白中的至少一种。优选地，切割步骤的效率是AsCas12a、FnCas12a或LbCas12a的基因组编辑效率的至少2倍。本公开还公开了一种提高V型CRISPR相关蛋白的切割效率的方法，所述方法包括：提供V型CRISPR相关蛋白；鉴定V型CRISPR相关蛋白的与SEQIDNO:1的位置925处的赖氨酸或SEQIDNO:3的位置930处的赖氨酸对齐的残基；以及将所述残基突变为赖氨酸。本公开提供了一种组合物，所述组合物包含：与SEQIDNO:1的残基829至残基991具有至少80％序列一致性的蛋白(或多肽)，其中所述蛋白在位置925处包含赖氨酸；和指导RNA，所述指导RNA包含与包含6至60个碱基的真核核酸序列反向互补的序列。本本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种组合物，包含：/ni)-iv)中的至少一种：/ni)与SEQ ID NO:1的残基829至残基991具有至少80％序列一致性的多肽，其中所述多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO:1的位置925处的赖氨酸对齐的赖氨酸；/nii)与SEQ ID NO:3的残基825至残基996具有至少80％序列一致性的多肽，其中所述多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO:3的位置930处的赖氨酸对齐的赖氨酸；/niii)与SEQ ID NO:1具有至少80％序列一致性的多肽，其中所述多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO:1的位置925处的赖氨酸对齐的赖氨酸；或者/niv)与SEQ ID NO:3具有至少80％序列一致性的多肽，其中所述多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO:3的位置930处的赖氨酸对齐的赖氨酸；/n以及/n与i)-iv)中的所述至少一种偶联的指导RNA，其中所述指导RNA包含与包含6至60个碱基的真核核酸序列反向互补的序列。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180809 KR 10-2018-0093336;20181030 US 62/752,9501.一种组合物，包含：
i)-iv)中的至少一种：
i)与SEQIDNO:1的残基829至残基991具有至少80％序列一致性的多肽，其中所述多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQIDNO:1的位置925处的赖氨酸对齐的赖氨酸；
ii)与SEQIDNO:3的残基825至残基996具有至少80％序列一致性的多肽，其中所述多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQIDNO:3的位置930处的赖氨酸对齐的赖氨酸；
iii)与SEQIDNO:1具有至少80％序列一致性的多肽，其中所述多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQIDNO:1的位置925处的赖氨酸对齐的赖氨酸；或者
iv)与SEQIDNO:3具有至少80％序列一致性的多肽，其中所述多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQIDNO:3的位置930处的赖氨酸对齐的赖氨酸；
以及
与i)-iv)中的所述至少一种偶联的指导RNA，其中所述指导RNA包含与包含6至60个碱基的真核核酸序列反向互补的序列。


2.如权利要求1所述的组合物，其中所述真核核酸序列是人核酸序列。


3.如权利要求2所述的组合物，其中所述人核酸序列包含处于KRAS、HER2/neu、PD-1、TCR、p53、CCR5、DNMT1、EMX1和LKB1中的区域。


4.如权利要求1所述的组合物，其中所述真核核酸序列是植物核酸序列。


5.如权利要求1所述的组合物，其中所述多肽是V型CRISPR相关蛋白。


6.如权利要求5所述的组合物，其中所述V型CRISPR相关蛋白是Cas12a蛋白。


7.如权利要求1所述的组合物，其中所述多肽还包含纯化标签。


8.如权利要求7所述的组合物，其中所述纯化标签包含选自由以下组成的组中的至少一种标签：His标签、FLAG标签、AU1表位标签、AU5表位标签、噬菌体T7标签、噬菌体V5表位标签、蓝舌病毒标签(B标签)、Glu-Glu标签(EE标签)、HSV表位标签、KT3表位标签、Myc表位标签、PDZ配体标签、聚精氨酸标签、聚天冬氨酸标签、聚半胱氨酸标签、聚苯丙氨酸标签、蛋白C标签、S1标签、S标签、Step标签和VSV-G标签。


9.如权利要求1所述的组合物，其中所述指导RNA包含富含A的原间隔子相邻基序(PAM)序列、富含G的PAM序列、富含T的PAM序列或富含C的PAM序列。


10.如权利要求9所述的组合物，其中所述PAM序列包含3个T核碱基、2个T核碱基、1个T核碱基或TTTN。


11.如权利要求1所述的组合物，其中所述指导RNA包含crRNA和tracrRNA。


12.如权利要求1所述的组合物，其中与AsCas12a、FnCas12a或LbCas12a相比，所述组合物显示出至少2倍增高的基因组编辑效率。


13.如权利要求1所述的组合物，进一步包含赋形剂。


14.如权利要求13所述的组合物，其中所述赋形剂具有7至8的pH。


15.如权利要求13所述的组合物，其中所述赋形剂是缓冲液。


16.如权利要求14所述的组合物，其中所述缓冲液包含Bis-Tris丙烷-HCl、MgCl2或牛血清白蛋白中的至少一种。


17.一种基因编辑的方法，其中所述方法包括：
提供组合物，所述组合物包含：
i)-iv)中的至少一种：
i...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔圣和，朴钟镇，尹智瑛，金汉成，金栋煜，
申请(专利权)人：GFLAS生命科学公司，首尔大学校产学协力团，
类型：发明
国别省市：韩国;KR