本文公开了包含内切核酸酶和外切核酸酶活性的增强的特异性核酸靶向复合物，以及允许在体内靶向降解特异性和/或非特异性核酸以及特异性时间调节核酸酶活性以防止脱靶活性的相关方法。通过实施本公开内容，核酸和携带核酸的细胞，如癌细胞或病原体，在体内选择性地降解。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】序列特异性体内细胞靶向交叉引用本申请要求于2018年4月3日提交的第62/652,150号美国临时申请、2018年8月29日提交的第62/724,199号美国临时申请和2018年3月27日提交的第KR10-2018-0035298号韩国专利申请的权益，所述申请均为了所有目的通过引用整体并入本文。
技术介绍
为了降解或细胞死亡而靶向特定细胞仍然是一个挑战。癌细胞群体或病原体细胞群体通常难以在不影响非病变宿主细胞群体的情况下靶向。因此，特别是对于虚弱的个体，以及对于通常患有或被确定为患有某种病况的个体，治疗方案会带来负面的健康后果，这些后果可能有害或可能负面地影响治疗方案的功效。
技术实现思路
本文提供了与核酸靶向有关的实施方案，其用于改善健康、减轻病症的至少一种症状、降低病原体负荷，或靶向特定细胞如癌细胞以供选择性消除。本文的方法和组合物涉及特定核酸分子的选择性靶向，以用于核酸内切和核酸外切降解。靶核酸通过指导核酸分子，如CRISPR或其他核蛋白复合物中的指导核酸分子，经由碱基配对来鉴定。切割靶核酸以引入双链断裂。然后，通过核酸外切活性，例如与核蛋白复合物的蛋白质组分相关或融合的核酸外切活性，促进靶核酸降解，这导致核酸从核酸内切引入的切割位点选择性地降解。另外，通过crRNA指导的序列特异性内切核酸酶活性诱导CRISPR或其他核蛋白复合物的非特异性外切核酸酶活性，从而非选择性降解细胞DNA/RNA分子。进一步的概述部分地通过参考下面列出的权利要求而获得。在各个方面，本公开提供了一种选择性诱导细胞中的细胞死亡的方法，该方法包括：a)向有需要的受试者施用嵌合多肽，该嵌合多肽包含具有序列特异性内切核酸酶活性的第一结构域和具有外切核酸酶活性的第二结构域、包含与所述细胞中的靶核酸互补的序列的指导核酸；以及b)切割所述靶核酸，从而诱导细胞死亡。在一些方面，所述靶核酸与病症相关。在一些方面，所述靶核酸在所述受试者的癌细胞中。在一些方面，所述靶核酸在所述受试者的健康细胞中不存在。在一些方面，所述靶核酸包含与癌症相关的序列。在一些方面，所述靶核酸包括RNA。在其他方面，所述靶核酸包括DNA。在一些方面，所述靶核酸在包含染色体异常的区域内。在一些方面，所述染色体异常选自：易位、缺失、重复、倒位、插入、环、拷贝数变异、插入缺失和等臂染色体。在一些方面，所述细胞在多个细胞中。在进一步的方面，所述多个细胞包含健康细胞。在一些方面，在施用后，健康细胞存活。在一些方面，在施用后，健康细胞增殖。在一些方面，所述切割包括在所述细胞中的一个或超过一个切割位点处切割。在一些方面，所述靶核酸与病症相关。在一些方面，所述癌症包括肺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌或宫颈癌。在一些方面，所述靶核酸包含对癌症为特异性的单核苷酸多态性、易位或与癌症进展相关的序列。在一些方面，所述靶核酸包含选自下组的基因的一部分：BRCA-1、BRAF、BCR-ABL、HER2、KIF5A、IRX1、ADAMTS16、GNPDA2、KCNE2、SLC15A5、SMIM11、DACH2、HERC2P2、CD68SHBG、ERBB2、KRT16、LINC00536、TRPS1、CDK8、TRAPPC9、HERC2P2、SIRPB1、MRC1、ATP11A、POTEB、HERC2P2、PRDM9、CDKN2B、HPV、LINE2(MT2)、CCR5或HPRT1。在一些方面，所述嵌合多肽进一步包含诱导型非特异性核酸酶活性。在一些方面，所述诱导型非特异性核酸酶活性通过所述嵌合多肽对靶核酸的位点特异性切割而被激活。在一些方面，所述第一结构域包括Cas12a(或Cpf1)结构域、Cas12a结构域、Cas12b结构域、Cas12c结构域、Cas12d结构域、Cas12e结构域、Cas12f结构域、Cas12g结构域、Cas12h结构域、Cas12i结构域、Cas13a结构域、Cas13b结构域、Cas14结构域或Cas9结构域。在进一步的方面，所述第一结构域包括Cas12a(或Cpf1)结构域。在其他方面，所述第一结构域包括Cas13a或Cas13b结构域。在另外其他方面，所述第一结构域包括Cas9结构域。在一些方面，所述指导核酸包含选自表6和第[00303]段或表7和第[00305]段中列出的序列的序列。在一些方面，所述第二结构域包括RecE结构域、RecJ结构域、T5结构域、λ外切核酸酶结构域、RecBCD结构域、DNApolI小片段结构域、ExoI结构域、ExoII结构域、ExoVII结构域、ExoT结构域、Trex1结构域或Trex2结构域。在一些方面，所述嵌合多肽产生3’OH突出端。在一些方面，所述嵌合多肽暴露出凹陷的3’OH。在一些方面，所述第二结构域包含具有切割的末端切除活性的酶。在一些方面，所述第二结构域包含绿豆核酸酶。在一些方面，所述靶核酸在所述受试者的健康细胞中不存在。援引并入本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度犹如具体地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入，包括2018年3月27日提交的韩国专利申请KR10-2018-0035298，其通过引用整体并入本文。附图说明通过参考以下对利用本专利技术原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述以及附图，将会对本专利技术的特征和优点获得一些理解，在这些附图中：图1显示了CRISPR/Cas复合物单链和双链核酸内切核酸酶和外切核酸酶活性的示意图。图2显示了CRISPER/Cas对靶和非靶核酸底物的活性的示意图。图3描绘了体外核酸酶活性测定结果。图4显示了体内毒性测定结果。图5显示了具有嘌呤霉素抗性的用于SpCas9和sgRNA转染的PX459质粒载体系统。PX459质粒载体图谱来自https://www.addgene.org/62988/。SpCas9和sgRNA在BbsI酶切割后和插入靶序列dsDNA寡核苷酸后表达。图6A-6B显示了在靶向拷贝数变异的PX459质粒DNA的氖电穿孔后六天，Cas9指导RNA在EGFR突变肺癌细胞系HCC827中引起的多切割诱导和细胞死亡。图6A显示了细胞的图像，其从左到右是以下处理：仅电穿孔脉冲而没有任何载体(对照)，用靶向野生型EGFR序列的载体进行电穿孔(对照)，以及用靶向突变序列的载体进行电穿孔。图6B显示了上述每种处理后的细胞数的条形图。图7显示了确认图8中每个样品的细胞形态的显微数据。在针对NT1、CCR5和HPRT1基因座的处理中，许多细胞存活。在针对MT2、SMIM11、GNPDA2、SLC15A5和KCNE2基因座的处理中，大多数细胞死亡。图8显示了每个处理组中的细胞活力的图示，包括针对NT1、CCR5、HPRT1、MT2、SMIM11、GNPDA2、SLC15A5和KCNE2基因座的处理。图9显示了在靶向不同基因座的CRISPR/Cas9构建体转染后的细胞活力数据，所述基因座包括lipo(仅本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种选择性诱导细胞中细胞死亡的方法，该方法包括：/na)向有需要的受试者施用嵌合多肽，该嵌合多肽包含具有序列特异性内切核酸酶活性的第一结构域和具有外切核酸酶活性的第二结构域、包含与所述细胞中的靶核酸互补的序列的指导核酸；以及/nb)切割所述靶核酸，从而诱导细胞死亡。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180327 KR 10-2018-0035298;20180403 US 62/652,1501.一种选择性诱导细胞中细胞死亡的方法，该方法包括：
a)向有需要的受试者施用嵌合多肽，该嵌合多肽包含具有序列特异性内切核酸酶活性的第一结构域和具有外切核酸酶活性的第二结构域、包含与所述细胞中的靶核酸互补的序列的指导核酸；以及
b)切割所述靶核酸，从而诱导细胞死亡。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸与病症相关。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸在所述受试者的癌细胞中。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸在所述受试者的健康细胞中不存在。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸包含与癌症相关的序列。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸包括RNA。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸包括DNA。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸在包含染色体异常的区域内。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述染色体异常选自：易位、缺失、重复、倒位、插入、环、拷贝数变异、插入缺失和等臂染色体。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞在多个细胞中。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述多个细胞包含健康细胞。
12.根据权利要求11所述的方法，其中在施用后，所述健康细胞存活。
13.根据权利要求11所述的方法，其中在施用后，所述健康细胞增殖。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述切割包括在所述细胞中的一个或超过一个切割位点处切割。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸与病症相关。
16.根据权利要求5所述的方法，其中所述癌症包括肺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌或宫颈癌。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸包含对癌症为特异性的单核苷酸多态性、易位或与癌症进展相关的序列。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸包含选自下组的基因的一部分：BRCA-1、BRAF、BCR-ABL、HER2、KIF5A、IRX1、ADAM...
【专利技术属性】
技术研发人员：印成镕，崔圣和，朴美珍，朴永勋，林正学，金栋煜，刘永东，朴钟镇，
申请(专利权)人：GFLAS生命科学公司，首尔大学校产学协力团，
类型：发明
国别省市：韩国;KR
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