修饰的PlySs2溶素及其用途制造技术

本文公开了其修饰的溶素多肽，其与具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的野生型PlySs2溶素多肽相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述至少一个氨基酸取代在所述CHAP结构域和/或所述SH3b结构域中，且其中所述修饰的溶素多肽或其片段抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长，减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群，或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种。本文进一步公开了包含修饰的溶素多肽的组合物，以及包含编码所述修饰的溶素多肽的核酸分子的载体。本文还公开了抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长、减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种的方法，治疗细菌感染的方法以及加强抗生素的效力或减少抗生素抗性的发展的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】修饰的PlySs2溶素及其用途相关申请的交叉引用本申请要求在2018年2月26日提交的美国临时专利申请号62/635,515的权益，且依靠其提交日，所述申请的全部公开内容通过引用并入本文。序列表本申请含有序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并且在此通过引用以其整体并入。所述ASCII副本，在2019年2月22日创建，命名为0341_0004-PCT_SL.txt，且大小为36,153字节。公开领域本公开总体上涉及抗细菌剂，并且更具体地涉及修饰的、非天然存在的溶素多肽，尤其是修饰的PlySs2裂解酶，以及这些肽在杀死革兰氏阳性细菌和对抗细菌感染和污染中的用途。专利技术背景抗生素抗性在全世界增加，尤其受到以下影响：(a)增加和长期使用经施用以治疗各种疾病和其他病况的抗生素；(b)患者依从性差；和(c)缺乏针对对现有抗生素发展抗性的病原体进行配置的新的抗微生物剂。细菌噬菌体内溶素(溶素)代表一种有前途的替代或补充方法，以对抗细菌感染和克服细菌抗性。溶素是可以由细菌噬菌体自然产生的肽聚糖水解酶。当接触来自外部的细菌时，重组产生的溶素多肽直接裂解并杀死细菌[1],[2]。溶素还可以通过促进抗生素药剂接近病原体来克服抗生素抗性。几项研究近来已经表明，这些酶在人和兽医中具有强大的潜力，以控制粘膜表面上、器官限制的感染中和全身感染中的病原体。革兰氏阳性细菌被含有多肽和多糖的细胞壁包围。革兰氏阳性细胞壁显现为宽、致密的壁，其可能为约20-80nm厚，并且含有许多相互连接的肽聚糖层。革兰氏阳性细胞壁的60%至90%是肽聚糖，提供细胞形状、刚性结构以及对渗透压的抗性。细胞壁不排除革兰氏染色结晶紫，允许细胞被染色为紫色，且因此被分类为“革兰氏阳性”。细菌噬菌体裂解酶已经被确立为可用于通过各种施用途径特异性治疗受试者中的各种类型的感染。参见例如美国专利号5,985,271；6,017,528；6,056,955；美国专利号6,248,324；美国专利号6,254,866；和美国专利号6,264,945。授予Fischetti等人的美国专利9,034,322(其在此通过引用以其整体并入)涉及源自猪链球菌细菌的细菌噬菌体溶素，包括溶素PlySs2。这些溶素多肽表明针对多种细菌(包括革兰氏阳性细菌，诸如葡萄球菌属、链球菌属B群、肠球菌属和李斯特氏菌属细菌菌株)的广泛的杀伤活性。PlySs2溶素能够在动物模型中杀死金黄色葡萄球菌细菌，与抗生素协同作用并克服(或预防)抗生素抗性。已显示PlySs2针对抗生素抗性金黄色葡萄球菌(诸如甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌(MRSA)和万古霉素抗性的金黄色葡萄球菌(VRSA))是有效的。通过治疗性蛋白引发炎性免疫应答是不期望的[6],[8]。对于外源蛋白和肽，蛋白免疫原性可能使人忧虑，无论它们是源自合成来源还是生物学(诸如重组)来源。在一些情况下，治疗性蛋白已引起严重的不良事件(例如，贫血、血小板减少症、过敏反应和先天性免疫应答)，其在某些情况下甚至可能是致命的。众所周知的实例包括在诱导与功能性非冗余内源性EPO交叉反应的中和抗体后，用促血小板生成素治疗的患者中的血小板减少症和用批准的促红细胞生成素(EPO)产品EPREX®治疗的慢性肾病患者中的纯红细胞发育不全。由于已经对于各种产品、包括单克隆抗体、血栓激酶和PULMOZYME®(链球菌DNA酶α)报道了免疫原性，免疫原性继续受到监管机构、行业和临床医生的极大关注。由于潜在的细菌感染，在已经经历炎性应答的患者中，此类免疫应答可能加重。由于溶素、诸如PlySs2是蛋白，它们当施用于宿主时具有引发免疫应答的潜力。除了引起严重的不利影响以外，如上所讨论，此类免疫应答还可以降低溶素的裂解活性。实际上，已经在具有其他类型的溶素(诸如Cpl-1)的动物中观察到一些免疫应答，其引起裂解活性的降低，但基本上没有抑制它。然而，其他研究人员观察到，Cpl-1的施用伴随着炎性细胞因子分泌的大量增加[9]。已经开发了计算机芯片上、计算机指导的工具，以促进鉴定蛋白的表位区域，和设计不易具有免疫原性的变体[11]-[18]。尽管此类技术可能有帮助，但它们具有一些限制。这些限制可能包括，例如：抗原加工，其可以消除一些推定的T-细胞表位；由于T-细胞受体的多形性和三维复杂性，无法使用计算机芯片上方法预测T-细胞受体亲和力；无法预测T-细胞表位表型；考虑患者群体对个体患者设计的统计技术的适用性的局限性以及翻译后因素的影响；和计算机芯片上技术的固有限制以及它们潜在的假设[8]。因此，在降低肽的免疫原性的努力中仍然存在尝试和错误以及不确定性。因此，发现保留期望的抗细菌活性、但具有降低的免疫原性的修饰的溶素、诸如修饰的PlySs2溶素会是有益的。专利技术概述本申请公开了修饰的溶素多肽，其相对于对应的野生型PlySs2溶素具有至少一个氨基酸取代，同时保留抗细菌活性和有效性。通常，与对应的野生型PlySs2溶素相比，修饰的溶素多肽还具有降低的免疫原性。野生型PlySs2溶素具有半胱氨酸、组氨酸依赖性的酰胺水解酶/肽酶(CHAP)内肽酶结构域(其为PlySs2多肽的酶促活性结构域(EAD))以及C-末端SH3b_5(SH3b)细胞壁结合结构域(CBD)。在某些方面，所述修饰的溶素多肽包含CHAP中的至少一个氨基酸取代和/或SH3b中的一个或多个氨基酸取代。在一个方面，本公开涉及修饰的溶素多肽，其与野生型PlySs2溶素多肽相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述野生型PlySs2溶素多肽具有SEQIDNO:1的氨基酸序列、半胱氨酸、组氨酸依赖性酰胺水解酶/肽酶(CHAP)结构域和细胞壁结合(SH3b)结构域，且其中至少一个氨基酸取代在CHAP结构域和/或SH3b结构域中，其中所述修饰的溶素多肽抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长，减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群，或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种。通常，与野生型PlySs2(SEQIDNO:1)相比，所述修饰的溶素多肽具有降低的免疫原性。在某些实施方案中，所述至少一个氨基酸取代在CHAP结构域中。在某些实施方案中，所述至少一个氨基酸取代在SH3b结构域中。在某些实施方案中，所述至少一个氨基酸取代在CHAP结构域和SH3b结构域中。在某些实施方案中，所述至少一个取代在CHAP结构域中的至少一个选自SEQIDNO:1的氨基酸残基35、92、104、128和137的位置中。在某些实施方案中，所述至少一个取代在SH3b结构域中的至少一个选自SEQIDNO:1的氨基酸残基164、184、195、198、204、206、212和214的位置中。在某些实施方案中，修饰的溶素多肽具有在CHAP结构域中的至少一个选自SEQIDNO:1的氨基酸35、92、104、128和137的位置中的至少一个取代和在SH3b结构域中的至少一个选自SEQIDNO:1的氨基酸164、184、195、198、204、206、212和214的位置中的至少一个取代。在一些实施方案中，CHAP结本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.修饰的溶素多肽，其与野生型PlySs2溶素多肽相比包含至少一个氨基酸取代，所述野生型PlySs2溶素多肽具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列、半胱氨酸、组氨酸依赖性酰胺水解酶/肽酶(CHAP)结构域和细胞壁结合(SH3b)结构域，其中所述至少一个氨基酸取代在所述CHAP结构域和/或所述SH3b结构域中，其中所述修饰的溶素多肽或其片段抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长，减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群，或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180226 US 62/6355151.修饰的溶素多肽，其与野生型PlySs2溶素多肽相比包含至少一个氨基酸取代，所述野生型PlySs2溶素多肽具有SEQIDNO:1的氨基酸序列、半胱氨酸、组氨酸依赖性酰胺水解酶/肽酶(CHAP)结构域和细胞壁结合(SH3b)结构域，其中所述至少一个氨基酸取代在所述CHAP结构域和/或所述SH3b结构域中，其中所述修饰的溶素多肽或其片段抑制革兰氏阳性细菌的至少一种物种的生长，减少革兰氏阳性细菌的至少一种物种的种群，或杀死革兰氏阳性细菌的至少一种物种。


2.权利要求1的修饰的溶素多肽，其中所述至少一个氨基酸取代在所述CHAP结构域中的至少一个选自SEQIDNO:1的氨基酸残基35、92、104、128和137的位置中和/或在所述SH3b结构域中的至少一个选自SEQIDNO:1的氨基酸残基164、184、195、198、204、206、212和214的位置中。


3.权利要求2的修饰的溶素多肽，其中所述CHAP结构域中的至少一个氨基酸取代是以下中的至少一个：R35E、L92W、V104S、V128T和Y137S。


4.权利要求2的修饰的溶素多肽，其中所述SH3b结构域中的至少一个氨基酸取代是以下中的至少一个：Y164N、Y164K、N184D、R195E、S198H、S198Q、V204K、V204A、I206E、V212A、V212E和V214G。


5.权利要求2的修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽具有所述CHAP结构域中的至少一个选自R35E、L92W、V104S、V128T和Y137S的氨基酸取代和所述SH3b结构域中的至少一个选自Y164N、Y164K、N184D、R195E、S198H、S198Q、V204K、V204A、I206E、V212A、V212E和V214G的氨基酸取代。


6.前述权利要求中任一项的修饰的溶素多肽，其在所述CHAP结构域中包含至少两个氨基酸取代。


7.前述权利要求中任一项的修饰的溶素多肽，其在所述SH3b结构域中包含至少两个氨基酸取代或至少三个氨基酸取代。


8.前述权利要求中任一项的修饰的溶素多肽，其中与SEQIDNO:1相比，所述修饰的溶素多肽包含3-9个氨基酸取代，其中所述3-9个氨基酸取代选自：R35E、L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164N、Y164K、N184D、R195E、S198H、S198Q、V204K、V204A、1206E、V212E、V212A和V214G。


9.前述权利要求中任一项的修饰的溶素多肽，其中所述至少一个氨基酸取代包含L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、N184D和S198Q。


10.前述权利要求中任一项的修饰的溶素多肽，其中所述CHAP结构域中的至少一个氨基酸取代包含L92W、V104S、V128T和Y137S。


11.前述权利要求中任一项的修饰的溶素多肽，其中所述至少一个氨基酸取代选自：
(i)L92W、V104S、V128T和Y137S；
(ii)Y164N、N184D、R195E、V204K和V212E；
(iii)L92W、V104S、V128T、Y137S、S198H和I206E；
(iv)L92W、V104S、V128T、Y137S、S198Q、V204A和V212A；
(v)L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、N184D和S198Q；
(vi)V128T、Y137S和Y164K；
(vii)R35E、L92W、V104S、V128T和Y137S；
(viii)L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、V204K和V212E；
(ix)L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、N184D、S198Q、V204K和V212E；
(x)L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164N和N184D；
(xi)L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164N和R195E；
(xii)L92W、V104S、V128T、Y137S、N184D、V204A和V212A；
(xiii)L92W、V104S、V128T、Y137S和Y164K；
(xiv)L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、I206E和V214G；和
(xv)L92W、V104S、V128T、Y137S、N184D和S198H。


12.前述权利要求中任一项的修饰的溶素多肽，其针对以下中的一种或多种具有的最小抑制浓度(MIC)为野生型PlySs2溶素的最小抑制浓度(MIC)的不大于约2倍、约3倍或约5倍：金黄色葡萄球菌；单核细胞增多性李斯特氏菌；金黄色葡萄球菌；凝固酶阴性...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·舒赫，C·因迪亚尼，M·维特金德，
申请(专利权)人：康特拉费克特公司，
类型：发明
国别省市：美国;US