一种蜂毒素-死亡素杂合肽突变体MTM及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种蜂毒素‑死亡素杂合肽突变体MTM及其应用，属于基因工程技术领域。本发明专利技术公开的一种蜂毒素‑死亡素杂合肽突变体MTM在抑制大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌活性中的应用。本发明专利技术首次利用枯草芽孢杆菌基因修饰的SamyX‑6His‑EDDIE‑MTM融合片段构建了高效的重组枯草芽孢杆菌BSMW表达系统，用于MTM的生物合成。从1L发酵上清液中可获得高达254.38mg的MTM。纯化的MTM的大小与预期分子量3.2kDa一致。MTM具有对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抗菌活性。

【技术实现步骤摘要】
一种蜂毒素-死亡素杂合肽突变体MTM及其应用
本专利技术涉及基因工程
，更具体的说是涉及一种蜂毒素-死亡素杂合肽突变体MTM及其应用。
技术介绍
抗生素滥用导致的耐药性问题日益严重，寻找全新类型的替代药物是解决耐药性问题的关键。抗菌肽以其独特的优势有望成为抗生素的理想替代品，但抗菌肽的来源问题一直是其开发应用的瓶颈。基因工程技术的快速发展一定程度上促进了抗菌肽的研究和开发。但与传统的抗生素相比，抗菌肽在抑杀活性、稳定性、细胞毒性等方面存在短板，研究者需进一步探究抗菌肽的抗菌机理及构效关系，对已有抗菌肽进行结构改造或设计新抗菌肽分子，从而在保证抗菌肽来源的前提下最大限度提高抗菌肽的实际使用价值。通常抗菌肽的获取途径有三种：从生物体提取；通过化学合成的方法获得；采用基因工程表达技术得到目标抗菌肽。但是天然抗菌肽是生物机体在外界因素诱导下产生的活性物质，在生物体内含量较低，因此从生物体直接提取效率较低，而且提取难度也很大，步骤烦琐，不易标准化生产，成本较高，难以保证提取物的纯度，很难实现规模化生产，而且对某些高等动植物及人类采用此种方法并不现实。随着多肽合成技术的不断提高，人工合成具有生物活性的肽类物质得以实现并快速发展。通常天然抗菌肽的相对分子质量较小，因此采用化学合成方法可以获得具有生物学活性的天然抗菌肽，但化学合成对技术要求严格，合成时间较长，而且价格昂贵成本高，难以实现大规模生产。现代基因工程技术的飞速发展为大规模生产抗菌肽提供了有效途径，弥补了上述两种获取方法的不足，是一种经济有效的获得抗菌肽的方法。蜂毒肽(melittin)又叫蜂毒素，是蜂毒的主要活性成分，占蜂毒干重的50％，是蜂毒中主要发挥作用的物质。蜂毒肽可以抗菌、抗病毒、消炎、抗辐射，最近又有对其抗癌作用进行研究的报道。蜂毒肽对革兰氏阳性菌和阴性菌都有很强的抑制作用，但它还有很强的溶血活性，限制了其临床应用。蜂毒肽具有破坏细胞膜、致死细胞的特性，因此要从原核和真核表达系统获得有活性的蜂毒肽，需要以融合蛋白形式表达。死亡素(Thanatin)是从半翅目昆虫刺肩蝽(Podisusmaculiventris)血淋巴中分离的具有广谱抗菌活性的昆虫抗菌肽，也是第一个生理浓度时对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌有抑制活性的抗菌肽。该肽具有杀细菌和杀真菌作用，具有迄今观察到的昆虫防御肽中最大的抗菌谱之一。因此，提供一种蜂毒素-死亡素杂合肽突变体MTM及其应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种蜂毒素-死亡素杂合肽突变体MTM及其应用。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种蜂毒素-死亡素杂合肽突变体MTM，其氨基酸序列如下：GIWAVLKVLTTWKPVPIIYCNRRTWKCQRM；SEQIDNO.4。进一步，所述的一种蜂毒素-死亡素杂合肽突变体MTM在抑制大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌活性中的应用。进一步，含有所述的蜂毒素-死亡素杂合肽突变体MTM的重组枯草芽孢杆菌BSMW的构建方法，具体步骤如下：(1)将SamyX-6His-EDDIE-MTM与pDM030载体通过酶切连接，获得重组质粒pDM045；所述SamyX-6His-EDDIE-MTM的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；(2)将重组质粒pDM045转化大肠杆菌DH5α，利用氯霉素筛选阳性克隆，通过测序对转化子进行验证；(3)将步骤(2)验证正确的阳性克隆利用电穿孔法转化到枯草芽孢杆菌WB700，构建获得重组枯草芽孢杆菌BSMW。经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开提供了一种蜂毒素-死亡素杂合肽突变体MTM及其应用，首次利用枯草芽孢杆菌基因修饰的SamyX-6His-EDDIE-MTM融合片段构建了高效的重组枯草芽孢杆菌BSMW表达系统，用于MTM的生物合成。从1L发酵上清液中可获得高达254.38mg的MTM。纯化的MTM的大小与预期分子量3.2kDa一致。MTM具有对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抗菌活性。在饲料添加剂、食品和化妆品防腐等领域，具有潜在的应用价值。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。图1附图为本专利技术MTM抗菌肽二级结构图；图2附图为本专利技术pDM045质粒构建过程示意图；图3附图为本专利技术经IPTG诱导的重组枯草芽孢杆菌BSMW菌株的菌量；图4附图为本专利技术SamyX-Eddie-MTM融合基因转录量；图5附图为本专利技术MTM累积产量；图6附图为本专利技术重组BSMW菌株发酵液中MTM的SDS-PAGE和Westernblot分析；其中，A为重组BSMW菌株发酵液中MTM的Tricine-SDS-PAGE分析；B为重组BSMW菌株发酵液中MTM的Westernblot分析；A和B中，泳道1：蛋白Marker，#P7702，NewEnglandBiolabs，USA；泳道2：重组枯草芽孢杆菌BSMW培养液经IPTG诱导后继续培养8h的发酵液处理样品；泳道3，枯草芽孢杆菌WB700培养液经IPTG处理后继续培养8h的发酵液处理样品；图7附图为本专利技术重组MTM的电喷雾电离质谱分析。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1杂合肽突变体MTM的设计，理化性质和结构预测(1)杂合肽突变体MTM的设计从抗菌肽数据库(http://aps.unmc.edu/AP/main.php)中获得蜂毒素和死亡素的原始多肽序列。蜂毒素由26个氨基酸组成，一级结构为GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ；SEQIDNO.1。死亡素由21个氨基酸组成，一级结构为GSKKPVPIIYCNRRTGKCQRM；SEQIDNO.2。生物公司根据杂合肽(M-T)序列GIGAVLKVLTTGKPVPIIYCNRRTGKCQRM(SEQIDNO.3)合成核苷酸序列，插入到pDM030载体，转化枯草芽孢杆菌WB700菌株，生产杂合肽(M-T)。然后利用抗菌肽分子设计方法经多轮试验得到蜂毒素-死亡素杂合肽突变体(MTM)，杂合肽突变体包含30个氨基酸，对3个位点(加粗和下划线)进行了定点突变，杂合肽突变体氨基酸序列如下：(2)MTM的理化性质和结构预测通过使用在线工具(多肽参数分析：https://web.expasy.org/protparam/)，可以预测原始肽本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蜂毒素-死亡素杂合肽突变体MTM，其特征在于，其氨基酸序列如下：GIWAVLKVLTTWKPVPIIYCNRRTWKCQRM；SEQ ID NO.4。/n

【技术特征摘要】
1.一种蜂毒素-死亡素杂合肽突变体MTM，其特征在于，其氨基酸序列如下：GIWAVLKVLTTWKPVPIIYCNRRTWKCQRM；SEQIDNO.4。


2.权利要求1所述的一种蜂毒素-死亡素杂合肽突变体MTM在抑制大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌活性中的应用。


3.含有权利要求1所述的蜂毒素-死亡素杂合肽突变体MTM的重组枯草芽孢杆菌BSMW的构建方法，其特征在于，具体步骤如...

【专利技术属性】
技术研发人员：姬生跃，李恒鑫，孟春颜，程磊，侯佩，刘小元，王小媛，周佰峰，张宁，
申请(专利权)人：中基高科北京生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11