一种细胞冻存液及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种细胞冻存液及其制备方法与应用，属于细胞保存技术领域。所述的细胞冻存液，包括甘露糖赤藓糖醇脂和海藻糖，还包括磷酸盐缓冲液。本发明专利技术将甘露糖赤藓糖醇脂作为细胞冻存液组分，能够促进细胞对海藻糖的吸收，增强细胞膜及骨架抵抗低温损伤的能力，稳定蛋白质及生物大分子，显著提高细胞的存活率。采用本发明专利技术的细胞冻存液，方便快速，将细胞和细胞冻存液混匀后可以不用常规的“慢冻”过程，直接置于液氮中保存即可保持较高的细胞存活率。

【技术实现步骤摘要】
一种细胞冻存液及其制备方法与应用
本专利技术属于细胞保存
，特别涉及一种细胞冻存液及其制备方法与应用。
技术介绍
表面活性剂广泛应用于人们日常生活中的多个方面，可用于清洁或作为配方助剂，以增加其他分子在化学品、化妆品、洗涤剂，食品，纺织品和药品等产品中的溶解、乳化和分散性能。目前红细胞的冷冻保存主要采用高浓度甘油或者二甲基亚砜。研究发现甘油与二甲基亚砜在非冷冻条件下具有细胞毒性，例如，DMSO会抑制细胞繁殖，改变细胞的生物学功能，因此，如果DMSO作为细胞冷冻保护剂，必须尽可能的缩短其在非冻结状态下与细胞的接触时间，在细胞使用前也要充分冲洗去除DMSO，而已进入细胞内的DMSO难以清洗掉，DMSO可能对细胞的生理功能和活性产生有害的影响。使用甘油作为红细胞冷冻保护剂，解冻后需要复杂的洗涤程序去除甘油，并且仍有甘油残留在细胞内部，对人体具有潜在危害。专利CN101333514B公开了一种利用含有DMSO和大分子胶体物质的高渗保存液配制成的红细胞冻存保护液。该保护剂可使红细胞进入高渗状态，同时相对锁住水分，降低溶质扩散速度，不会引起大量溶血且可以抑制红细胞外冰晶对细胞膜的破坏作用，简单、省时。但是该专利不能确保在解冻后洗涤程序中充分去除DMSO，对人体可能具有一定的毒害作用。近年来，新的冻存保护剂如海藻糖等被用于细胞低温冻存中，海藻糖是由2个葡萄糖分子以α,α-1,1-糖苷键构成的非还原性双糖，具有对生物抗脱水、抗冷冻、抗高渗的作用，但由于细胞膜对海藻糖的非渗透性，所以一般情况下海藻糖不能透过细胞膜，而越来越多的研究表明，只有当海藻糖进入细胞内部后才能更好的对细胞膜和胞内蛋白起到有效的保护作用。甘露糖赤藓糖醇脂是一类由霉菌或酵母菌产生的生物表面活性剂，其生产菌株为非致病菌，与人体和环境有良好的相容性。除此以外，甘露糖赤藓糖醇脂具有良好的分散、乳化、增溶特性等优点，还具有很好的抗肿瘤、抗病毒、抑制白细胞的增长等特点，为生物分子、细胞膜、细胞器以及医用生物制品的研究和使用带来了极大方便，为人类健康作出很大的贡献，具有巨大的研究价值和经济效益。然而，目前尚未见有将甘露糖赤藓糖醇脂应用于细胞冻存液中的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服由于海藻糖无法进入细胞内部导致对细胞膜和胞内蛋白的冻存效果不佳的缺陷，提供一种细胞冻存液，旨在促进细胞对海藻糖的吸收，增强细胞膜及骨架抵抗低温损伤的能力，稳定蛋白质及生物大分子，显著提高细胞的存活率。本专利技术的另一个目的在于提供上述细胞冻存液的制备方法。本专利技术的再一目的在于提供上述细胞冻存液的应用。本专利技术的上述目的通过以下技术方案实现：一种细胞冻存液，包括甘露糖赤藓糖醇脂、海藻糖和磷酸盐缓冲液。所述的细胞优选包括红细胞。所述的红细胞优选来自脐血和外周血中的至少一种。所述的细胞冻存液中，甘露糖赤藓糖醇脂与海藻糖优选按摩尔浓度比1～10:0.2～0.3计算；更优选地，所述的细胞冻存液中，甘露糖赤藓糖醇脂的摩尔浓度为1～10mol/L，海藻糖的摩尔浓度为0.2～0.3mol/L。所述的磷酸盐缓冲液的pH为7.4、摩尔浓度为0.01mol/L。一种细胞冻存液的制备方法，通过将甘露糖赤藓糖醇脂、海藻糖混匀，然后再加入磷酸盐缓冲液搅拌混匀得到。所述的细胞冻存液在细胞冻存中的应用。上述细胞冻存液的使用方法，包括如下步骤：(1)细胞冻存：将待冻存细胞加入到盛有细胞冻存液的容器中，将上述盛有待冻存细胞和细胞冻存液的容器浸入液氮中，即可实现对细胞的保存；其中，待冻存细胞与细胞冻存液按体积比15～25:85～75计算。(2)细胞解冻：将盛有待冻存细胞和细胞冻存液的容器从液氮中取出，水浴加热，直至细胞解冻复苏，得到解冻复苏后的细胞，然后加入生理盐水离心去上清，洗涤，将洗涤后的细胞用生理盐水配置成细胞盐水悬液，即得解冻去冻存液且复苏的红细胞。步骤(1)中所述的细胞优选包括红细胞。步骤(2)中所述的水浴加热的条件优选为37℃水浴加热0.5～1.5min；更优选为37℃水浴加热1min。步骤(2)中所述的离心的条件优选为：800g离心5分钟。步骤(2)中所述的洗涤优选为用生理盐水洗涤。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点及有益效果：(1)本专利技术将甘露糖赤藓糖醇脂作为细胞冻存液组分，能够促进细胞对海藻糖的吸收，增强细胞膜及骨架抵抗低温损伤的能力，稳定蛋白质及生物大分子，显著提高细胞的存活率。(2)采用本专利技术的细胞冻存液，方便快速，将细胞和细胞冻存液混匀后可以不用常规的“慢冻”过程，直接置于液氮中保存即可保持较高的细胞存活率。(3)甘露糖赤藓糖醇脂可增加细胞膜表面通透性，促进对海藻糖的吸收，在冻存细胞时减少形成冰晶的数量和大小，可以不用常规的先程序降温，再转移至液氮中的复杂的“慢冻”过程。(4)相较于采用传统的甘油和DMSO作为红细胞冻存液，本专利技术在解冻时不需要使用不同浓度的甘油进行梯度洗脱，而且本专利技术中的甘露糖赤藓糖醇脂和海藻糖与人体具有良好的相容性。附图说明图1为实施例2中红细胞内海藻糖含量随甘露糖赤藓糖醇脂加入量变化结果图。图2为实施例2中红细胞溶血率随甘露糖赤藓糖醇脂加入量的变化结果图。图3为实施例1和对比例3的方法冻存后红细胞的形态结果图；其中，图A为实施例1的方法冻存后红细胞的形态结果图；图B为对比例3的方法冻存后红细胞的形态结果图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例中所涉及的试剂、方法，如无特殊说明，均为本领域常用的试剂和方法，本领域的技术人员在本专利技术的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本专利技术所要求保护的范围。脐血来源于广东省脐带血造血干细胞库；甘露糖赤藓糖醇脂购于武汉远成共创科技有限公司；海藻糖购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；磷酸盐缓冲液(pH7.4、0.01mol/L)购于赛默飞世尔科技有限公司。细胞复苏活率(％)采用MTT法检测。实施例1：取脐血50mL，加入枸橼酸钠抗凝剂10mL，800g离心10min去除血浆和血小板，得到预处理后的红细胞。一种细胞冻存液，由甘露糖赤藓糖醇脂、海藻糖和磷酸盐缓冲液组成；其中甘露糖赤藓糖醇脂的摩尔浓度为10mol/L，海藻糖的摩尔浓度为0.25mol/L，磷酸盐缓冲液的pH为7.4、摩尔浓度为0.01mol/L。上述细胞冻存液的使用方法，具体操作如下：(1)细胞冻存：将20mL红细胞加入到盛有80mL细胞冻存液的冻存管中，将上述盛有待冻存细胞和细胞冻存液的冻存管浸入液氮中，即可实现对细胞的保存；(2)细胞解冻：将盛有待冻存细胞和细胞冻存液的冻存管从液氮中取出，37℃水浴加热约1min，直至细胞解冻复苏，得到解冻复苏后的细胞，然后细胞用100mL生理盐水于800本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞冻存液，其特征在于，包括甘露糖赤藓糖醇脂、海藻糖和磷酸盐缓冲液。/n

【技术特征摘要】
1.一种细胞冻存液，其特征在于，包括甘露糖赤藓糖醇脂、海藻糖和磷酸盐缓冲液。


2.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述的细胞包括红细胞。


3.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述的细胞冻存液中，甘露糖赤藓糖醇脂与海藻糖按摩尔浓度比1～10:0.2～0.3计算。


4.根据权利要求3所述的细胞冻存液，其特征在于，所述的细胞冻存液中，甘露糖赤藓糖醇脂的摩尔浓度为1～10mol/L，海藻糖的摩尔浓度为0.2～0.3mol/L。


5.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述的磷酸盐缓冲液的pH为7.4、摩尔浓度为0.01mol/L。


6.一种细胞冻存液的制备方法，其特征在于，通过将甘露糖赤藓糖醇脂、海藻糖混匀，然后再加入磷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏伟，嵐山芮，刘松，
申请(专利权)人：广州瑞铂茵健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44