使用聚酰亚胺多孔膜的细胞的长期培养及冷冻保存方法技术

本发明专利技术涉及使用聚酰亚胺多孔膜的细胞的长期培养方法，细胞培养装置和试剂盒。本发明专利技术还涉及使用聚酰亚胺多孔膜的细胞的冷冻保存方法和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
使用聚酰亚胺多孔膜的细胞的长期培养及冷冻保存方法本申请是2016年1月26日提交的专利技术名称为“使用聚酰亚胺多孔膜的细胞的长期培养、与使用聚酰亚胺多孔膜的细胞的冷冻保存方法”的专利技术专利申请201680007125.4的分案申请。
本专利技术涉及，细胞的长期培养方法、细胞培养装置和试剂盒。详细地说，涉及使用聚酰亚胺多孔膜的细胞的长期培养方法，细胞培养装置和试剂盒。此外，本专利技术涉及细胞的冷冻保存方法和试剂盒。具体而言，涉及使用聚酰亚胺多孔膜的细胞的冷冻保存方法和试剂盒。
技术介绍
【细胞培养】细胞在体内一般作为三维群体存在，在经典的平面培养中，细胞以粘到容器的形式单层培养。在附着细胞的培养中，长期以来，不同的培养方法已通过培养皿等被开发。通过这种培养皿等进行培养的情况下，培养细胞持续增殖，成为被称为“铺满”的无法再增殖更多的情况下，增殖停止。虽然也取决于细胞类型，在不传代的情况下如果继续这种铺满状态，那么在一定的时间段后，开始自发地剥落，细胞不能传代的情况也在许多细胞中被发现。随着再生医疗中对由细胞移植与细胞的物质生产得到更多关注，附着细胞的培养方法不断增长的需求。迄今，利用微载体等的载体的疑似悬浮培养或使用工作表面的球状体培养或使用中空纤维作为细胞培养场所的中空纤维培养等，如各种立体培养和载体培养等已被开发。中空纤维培养在被保护在牢固的中空纤维的环境下，作为将细胞恒定和长期培养的方法论而进行处理，此外，微载体培养、通过空气升液法或以连续培养为目的的装置的设计的长期培养也已经被尝试过很多。这些方法的特点是通过向应用载体的生长空间赋予三维环境而扩大增殖场所，在这种大的生长场所中通过装置设计和方法设计使得载体其自身在牢固环境中得到保护，目的是使得培养期间延长。在另一方面，在这些方法中使用的系统，是那些需要复杂的装置或大容量装置的，或一旦培养开始，成为难以干预培养环境本身的封闭系统的情况多见。因此，虽然将细胞长期培养、而且可以方便处理系统的方法论被需求，但是，恰当的方法论还没有被开创。在另一方面，如非专利文献1和2中所示，关于模仿体内器官的长期细胞培养方法，已经报道使用立体载体的研究例子。这些都是胰脏的胰岛的重建活体包埋实验或试验管内的骨髓细胞长期培养等，旨在部位选择性重建的研究成果事例。虽然存在针对长期培养课题3维立体环境中的细胞培养物的意义和价值被示出的重要成就，各个载体对每个用途具有高度特异性，所用的材料是生物相容性材料的纤维状结构体和通过绘图构成的高级结构体，因此，缺乏通用性，处理也缺乏一般性。更简单和可适用于多样化状态的方法论的发展已经被期望。细胞通过其生存形式的特征，主要分为附着细胞和悬浮细胞两种。任何细胞在进行人工培养的情况下，通过细胞接种、培养、增殖、传代、经由冷冻保存这样的周期。近来，随着使用培养细胞的疫苗，酶，激素，抗体，细胞因子等的体内蛋白质等的生产和或再生医疗中细胞移植得到更多关注，将大量的细胞有效地并且简单地培养的方法正在被开发。特别地，使用载体的细胞培养方法，由于效率方面的吸引力和通用性而得到多方面注意，有各种各样的方法正在开发。一般地，这些细胞培养涉及与细胞冷冻保存有关的技术，也从许多方面进校研究。存在以下报道：脱离经典冷冻法，尝试更容易地通过培养板本身的细胞冷冻的技术和(专利文献4)，使用立体载体、旨在改善冷冻方面细胞生存率的方法(专利文献5)，或者，通过使用纤维性载体，改进培养细胞的冷冻保存特性的实例(专利文献6)，检验干细胞的生存效率的实例(非专利文献3)等的报道。然而，作为冷冻保存介质，被限制为具有独特结构的纤维性材料，但这种材料，虽然具有作为冷冻保存介质的机能，但是不是作为细胞培养载体原样可以使用的材料，只能作为暂时保持体而被利用。简便且有效地，从冷冻保存到的细胞(细胞唤醒)解冻、从使用到再冷冻可以自始至终地实施的/新方法论的构建是被期望的。【聚酰亚胺多孔膜】该聚酰亚胺是包含在重复单元中具有酰亚胺键的高分子(聚合物)的总称。芳族聚酰亚胺是指芳族化合物通过直接酰亚胺键被连接的高分子(聚合物)。由于芳族聚酰亚胺具有芳族和芳族通过酰亚胺键的共轭结构，具有刚性和牢固的分子结构，并且由于酰亚胺键具有强的分子间力，具有非常高的水平的热的，机械的，化学的性质。聚酰亚胺多孔膜过滤器在本专利技术前更多地用于滤器，低介电常数膜，燃料电池电解质膜，特别地以电池关系中心的用途。专利文献7-9中记载了，特别是在气体等物质透过性中是优异的，孔隙率高，两个表面的平滑性优异，相对强度高，孔隙率高，但是对于膜厚度方向的压缩应力耐力优良的具有大量大孔隙的聚酰亚胺多孔膜。【现有技术文献】【专利文献】专利文献1：特开平5-123168专利文献2：特开平10-108673专利文献3：特公平6-30570专利文献4：特开2002-34551专利文献5：特许第5140155号专利文献6：特开2003-47464专利文献7：WO2010/038873专利文献8：特开2011-219585专利文献9：特开2011-219586【非专利文献】非专利文献1：Mortera-Blancoetal.,Biomaterials32(2011)9263-9270非专利文献2：Daoudetal.,Biomaterials32(2011)1536-1542非专利文献3：A.Bissoyietal./Cryobiology68(2014)332-342【专利技术概述】【专利技术要解决的课题】本专利技术的目的是提供，适应所要求的条件和形式，能够简便且稳定地长期培养细胞，针对在培养中的变化也能够容易应对的细胞培养方法，并且，提供用于在培养方法中使用的细胞培养装置和试剂盒。此外，本专利技术的目的是提供，简便且有效地，从细胞的冷冻保存到细胞的解冻(细胞唤醒)，从使用到重新冷冻，可以自始至终地实施的细胞的冷冻方法。【用于解决课题的手段】本专利技术人等发现，通过使用聚酰亚胺多孔膜进行细胞培养，可以将细胞效率良好地在长期间内培养。本专利技术优选包括，但不限于，以下的方式。[实施方式1]细胞的长期培养方法，其是包括(1)将细胞播种到聚酰亚胺多孔膜，和(2)将播种了细胞的聚酰亚胺多孔膜由细胞培养基润湿，将细胞培养30天以上的方法。[实施方式2]实施方式1所述的方法，在工序(2)中，培养细胞60天以上。[实施方式3]实施方式1所述的方法，在工序(2)中，培养细胞120天以上。[实施方式4]实施方式1-3之任一项所述的方法，两种以上的聚酰亚胺多孔膜上下或左右地层叠在细胞培养基中。[实施方式5]实施方式1-4之任一项所述的方法，将聚酰亚胺多孔膜(i)折叠，(ii)卷成卷状，(iii)将片材或小片通过丝状结构体连接，或(iv)系成绳状...

【技术保护点】
1.细胞的冷冻保存方法，其包括以下工序：/n(1)将细胞承载至聚酰亚胺多孔膜的工序，/n(2)将承载了细胞的聚酰亚胺多孔膜放置在冷冻细胞的条件下，由此冷冻由聚酰亚胺多孔膜承载的细胞的工序，和/n(3)将承载了细胞的聚酰亚胺多孔膜以保持冷冻状态的条件保存的工序，/n其中，/n所述聚酰亚胺多孔膜具有多层结构，所述多层结构至少具有：/n两个表面层A面和B面、和/n夹在所述两个表面层A面和B面之间的大空隙层，/n所述A面中存在的孔的平均孔径小于所述B面中存在的孔的平均孔径，/n所述大空隙层具有：/n结合到表面层A面和B面的隔壁、以及/n由所述隔壁和所述表面层A面和B面所包围的多个大空隙。/n

【技术特征摘要】
20150126 JP 2015-012537;20150126 JP 2015-0128101.细胞的冷冻保存方法，其包括以下工序：
(1)将细胞承载至聚酰亚胺多孔膜的工序，
(2)将承载了细胞的聚酰亚胺多孔膜放置在冷冻细胞的条件下，由此冷冻由聚酰亚胺多孔膜承载的细胞的工序，和
(3)将承载了细胞的聚酰亚胺多孔膜以保持冷冻状态的条件保存的工序，
其中，
所述聚酰亚胺多孔膜具有多层结构，所述多层结构至少具有：
两个表面层A面和B面、和
夹在所述两个表面层A面和B面之间的大空隙层，
所述A面中存在的孔的平均孔径小于所述B面中存在的孔的平均孔径，
所述大空隙层具有：
结合到表面层A面和B面的隔壁、以及
由所述隔壁和所述表面层A面和B面所包围的多个大空隙。


2.权利要求1所述的方法，其中在工序(1)中，通过在聚酰亚胺多孔膜接种细胞，使细胞承载于聚酰亚胺多孔膜。


3.权利要求1所述的方法，其中在工序(1)中，通过将细胞接种到聚酰亚胺多孔膜而培养，使细胞承载于聚酰亚胺多孔膜。


4.权利要求1所述的方法，其中在工序(3)之后还包括：
(4)将承载了细胞的聚酰亚胺多孔膜在解冻细胞的条件下放置，由此使由聚酰亚胺多孔膜承载的细胞解冻。


5.权利要求4所述的方法，其中在工序(4)之后还包括：
(5)将细胞解冻的聚酰亚胺多孔膜由细胞培养基润湿而培养细胞的工序。


6.权利要求5所述的方法，其中在工序(5)中，培养细胞直到培养的细胞在聚酰亚胺多孔膜外也增殖。


7.权利要求5所述的方法，其中在工序(5)中，与细胞解冻的聚酰亚胺多孔膜一同、将不承载细胞的另外一个或多个聚酰亚胺多孔膜由细胞培养基润湿并培养，由此，使细胞承载于另外一个或多个聚酰亚胺多孔膜。


8.权利要求5所述的方法，其中在工序(5)之后还包括：
(6)将承载了细胞的聚酰亚...

【专利技术属性】
技术研发人员：萩原昌彦，清水基久，和田幸周，
申请(专利权)人：宇部兴产株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP