用于将DNA靶向插入基因中的方法技术

用于使用稀有切割核酸内切酶和转座酶修饰内源基因的编码序列的方法和组合物。本文所述的方法和组合物能够用于修饰内源基因的编码序列。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于将DNA靶向插入基因中的方法相关申请的交叉引用本申请要求于2018年10月16日提交的早先提交且共同未决的申请USSN62/746,497、于2019年4月8日提交的USSN62/830,654和于2019年6月20日提交的USSN62/864,432的权益，所述文献的内容通过全文引用的方式并入本文。序列表本申请含有已经以ASCII格式经由EFS-Web递交的序列表并且将所述序列表通过全文引用的方式特此并入。创建于2019年10月14日的所述ASCII副本的名称为SEQUENCE_LISTING_BA2018-4WO_P12987WO00.txt并且大小为517,036字节。
本文件属于基因组编辑领域。更具体地，本文件涉及使用稀有切割核酸内切酶或转座酶对内源基因的靶向修饰。
技术介绍
单基因病症是由单个基因中的一个或多个突变引起的，其示例包含镰状细胞疾病(血红蛋白-β基因)、囊性纤维化(囊性纤维化跨膜传导调节基因)和泰-萨二氏病(Tay-Sachsdisease)(β-己糖胺酶A基因)。单基因病症一直是基因疗法所关注的对象，因为用功能性拷贝替代有缺陷的基因可以为治疗提供益处。然而，用于产生有效疗法的一个瓶颈包含基因的功能性拷贝的大小。许多递送方法(包含那些使用病毒的递送方法)具有大小限制，其阻碍了大型转基因的递送。进一步地，许多基因具有选择性剪接模式，从而导致单个基因编码多种蛋白质。用于纠正有缺陷的基因的部分区域的方法可以提供用于治疗单基因病症的替代性手段。专利技术内容基因编辑有望纠正遗传病症中发现的突变，然而，为个体病症创建有效的疗法仍然存在许多挑战，包含由功能获得性突变引起的病症或需要精确修复的病症。这些挑战是在如脊髓小脑共济失调3和脊髓小脑共济失调6等病症的情况下看到的，其中所述病症是由基因的3'末端处的功能获得性突变(扩展的三核苷酸重复序列)引起的。本文所述的方法提供了用于纠正基因的3'末端处发现的突变的新颖方法。本文的公开内容至少部分地基于与通过多个修复途径的整合相容的双模块转基因的设计。本文所述的转基因可以通过同源重组途径、非同源末端连接途径或同源重组途径和非同源末端连接途径两者或通过转座整合到基因中。进一步地，任何情况(HR、NHEJ正向、NHEJ反向、转座正向或转座反向)下的整合结果都可以引起靶基因的蛋白产物的精确纠正/改变。本文所述的转基因可以用于在所关注基因的3'区域中固定或引入突变。所述方法在需要精确编辑基因或靶向的突变内源基因由于其超过标准载体或病毒载体的大小容量而无法被合成拷贝“替代”的情况下特别有用。本文描述的方法可以用于应用研究(例如，基因疗法)或基础研究(例如，创建动物模型或理解基因功能)。本文描述的方法与当前体内递送媒剂(例如，腺相关病毒载体和脂质纳米颗粒)相容，并且其解决了实现基因产物的精确改变的若干挑战。在一个实施例中，本文件的特征在于一种用于将转基因整合到内源基因中的方法。所述方法可以包含递送转基因，其中所述转基因携带第一剪接受体序列和第二剪接受体序列、第一部分编码序列和第二部分编码序列以及第一终止子和第二终止子。在一些实施例中，所述第一终止子和所述第二终止子可以被单个双向终止子替代。所述方法还包含施用靶向所述内源基因内的位点的一种或多种稀有切割核酸内切酶，其中然后将所述转基因整合到所述内源基因中。所述转基因可以靶向内含子内或内含子-外显子连接部处的位点。所述第一部分编码序列和所述第二部分编码序列可以以尾接尾朝向来定向，使得通过NHEJ在任一方向(即正向或反向)上整合转基因可以引起基因的蛋白产物的精确改变。在其它实施例中，所述转基因可以包含左同源臂和右同源臂以使得能够通过HR整合。这些转基因可以被携带在腺相关病毒载体(AAV)内，其中所述转基因可以通过HR(通过同源臂)或通过NHEJ正向方向或NHEJ反向方向整合(通过将所述AAV载体直接整合到靶双链断裂中)。在一个实施例中，具有第一编码序列和第二编码序列以及左同源臂和右同源臂的载体还可以包含用于由一种或多种稀有切割核酸内切酶切割的第一位点和第二位点。所述一种或多种稀有切割核酸内切酶的切割可以引起具有同源臂的线性转基因的释放，所述线性转基因能够通过HR或NHEJ整合到基因组中。在另一个实施例中，具有第一编码序列和第二编码序列的载体可以侧接有用于由一种或多种稀有切割核酸内切酶切割的第一位点和第二位点。所述一种或多种稀有切割核酸内切酶的切割可以引起线性转基因的释放，所述线性转基因能够通过NHEJ整合到基因组中。在另一个实施例中，具有第一编码序列和第二编码序列的载体可以侧接有左和右转座子末端。CRISPR相关转座酶(例如，Cas6/7/8以及TniQ、TnsA、TnsB和TnsC)的递送可以通过转座整合转基因。所述方法可以用于改变由内源基因产生的蛋白质的C端。在一些实施例中，内源基因可以包含ATXN3基因或CACNA1A基因。ATXN3是编码酶脊髓小脑共济失调蛋白(ataxin)-3的基因。脊髓小脑共济失调蛋白-3是有助于破坏过量或受损的蛋白质的泛素-蛋白酶体系统的成员。3型脊髓小脑共济失调是由ATXN3基因的3'末端内的三核苷酸重复序列扩展引起的遗传病症。CACNA1A是编码参与钙通道形成的蛋白质的基因。6型脊髓小脑共济失调是由CACNA1A基因的突变引起的遗传病症。导致SCA6的突变包含在CACNA1A基因的3'末端中的三核苷酸重复序列扩展。在一些实施例中，本文提供的方法可以用于改变内源ATXN3基因或CACNA1A基因的3'末端。在具体实施例中，用于本文所述的转基因的整合的靶标可以是ATXN3基因的内含子9或CACNA1A基因的内含子46。除非另外定义，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语的含义与本专利技术涉及的领域的普通技术人员通常理解的含义相同。虽然类似于或等同于本文所描述的那些方法和材料的方法和材料可以用于本专利技术的实践中，但是下面描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献出于所有目的通过引用以其整体并入本文。在有矛盾的情况下，以本说明书(包含定义)为准。另外，材料、方法和示例仅是说明性的并不旨在是限制性的。在以下描述中阐述了本专利技术的一个或多个实施例的细节。根据所述描述和权利要求，本专利技术的其它特征、目的和优点将变得显而易见。附图说明图1是用于靶向插入到内源基因中的转基因的图示。TS1，靶位点1；SA1，剪接受体位点1；CDS1，编码序列1；T1，终止子1；TS2，靶位点2；SA2，剪接受体位点2；CDS2，编码序列2；T2，终止子2；HA1，同源臂1；HA2，同源臂2；BT1，双向终止子1；AS1，另外的序列1；AS2，另外的序列2。图2是示出了转基因整合到示例性基因中的图示。转基因包括用于一种或多种稀有切割核酸内切酶的两个靶位点、两个剪接受体序列、两个编码序列(3.1和3.2)和两个终止子(T)。整合通过非同源末端连接(NHEJ)进行。图3是示出了转基因整合到示例性基因中的图示。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种将转基因整合到内源基因中的方法，所述方法包括：/na.施用转基因，其中所述转基因包括/ni.第一剪接受体序列和第二剪接受体序列，/nii.第一部分编码序列和第二部分编码序列，以及/niii.一个双向终止子或第一终止子和第二终止子；/nb.施用靶向所述内源基因内的位点的至少一种稀有切割核酸内切酶，/n其中所述转基因整合在所述内源基因内。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181016 US 62/746497;20190408 US 62/830654;2019061.一种将转基因整合到内源基因中的方法，所述方法包括：
a.施用转基因，其中所述转基因包括
i.第一剪接受体序列和第二剪接受体序列，
ii.第一部分编码序列和第二部分编码序列，以及
iii.一个双向终止子或第一终止子和第二终止子；
b.施用靶向所述内源基因内的位点的至少一种稀有切割核酸内切酶，
其中所述转基因整合在所述内源基因内。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一剪接受体能够操作地连接到所述第一部分编码序列，并且所述第二剪接受体能够操作地连接到所述第二部分编码序列。


3.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一部分编码序列能够操作地连接到所述第一终止子，并且所述第二部分编码序列能够操作地连接到所述第二终止子。


4.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一部分编码序列和所述第二部分编码序列能够操作地连接到所述双向终止子。


5.根据权利要求3所述的方法，其中将所述第一剪接受体和所述第二剪接受体、所述第一编码序列和所述第二编码序列以及所述第一终止子和所述第二终止子以尾接尾朝向定向。


6.根据权利要求5所述的方法，其中所述转基因还包括用于一种或多种稀有切割核酸内切酶的第一靶位点和第二靶位点，其中所述靶位点在所述第一剪接受体和所述第二剪接受体的侧端。


7.根据权利要求5所述的方法，其中所述转基因还包括在所述第一剪接受体和所述第二剪接受体的侧端的左同源臂和右同源臂。


8.根据权利要求7所述的方法，其中所述转基因被携带在腺相关病毒载体内。


9.根据权利要求7所述的方法，其中所述转基因还包括用于所述一种或多种稀有切割核酸内切酶的第一靶位点和第二靶位点，其中所述靶位点在所述第一剪接受体和所述第二剪接受体的侧端。


10.根据权利要求9所述的方法，其中所述第一靶位点和所述第二靶位点在第一同源臂和第二同源臂的侧端。


11.根据权利要求1所述的方法，其中所述转基因整合在所述内源基因的内含子内或内含子-外显子连接部处。


12.根据权利要求1所述的方法，其中所述转基因整合在ATXN3基因或CACNA1A基因的内含子内或所述内含子-外显子连接部处。


13.根据权利要求12所述的方法，其中所述转基因包括编码由非致病性ATXN3基因的外显子10产生的肽的第一部分编码序列和第二部分编码序列，并且靶向致病性ATXN3基因的内含子9或内含子9外显子10连接部。


14.根据权利要求12所述的方法，其中所述转基因包括编码由非致病性CACNA1A基因的外显...

【专利技术属性】
技术研发人员：N·巴尔茨，
申请(专利权)人：蓝色等位基因有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国;US