用于无标签编码化学文库筛选的微珠制造技术

本申请公开了一种编码的化学文库微珠，该微珠上或微珠内已固定有：(i)编码标签；和(ii)靶测试系统报告部分，其中，所述报道部分在不存在针对靶的活性的情况下以第一状态存在，并且在所述活性存在的情况下以第二状态存在，并且其中所述微珠进一步包含一个或多个化学结构的克隆群，所述化学结构可释放地连接到所述标签并由所述标签编码。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于无标签编码化学文库筛选的微珠
本专利技术涉及微珠和包含微珠的微区室(例如微滴)，以及根据其编码的化学文库。本专利技术还涉及用于筛选编码文库的方法。
技术介绍
药物发现通常包括：大型化合物文库的汇编，然后进行测试或筛选，其中将化合物各自添加到包含目标物的微孔中以鉴定“命中物(hits)”，该“命中物”在目标物上显示所需活性(例如酶活性或标签位移)。此过程被称为高通量筛选(HTS)。尽管可以通过使用机器人设备使该过程自动化以测试数百万种化学物质，但它既费力又昂贵。因此，存在根本性问题，其源于增加的文库规模增加了筛选负担的事实：由于筛选测试具有离散性，筛选时间和成本规模与文库大小近似呈线性关系。这对可使用这种方法筛选的化学文库大小施加了严重的实际限制：HTS通常应用于包含103-106个成员的文库。基于选择的筛选技术(例如，淘选(panning)技术)的发展已经解决了这个问题。在此技术中，文库中的所有化合物同时进行测试，以一锅(one-pot)式的方式测试它们与感兴趣的目标物进行相互作用的能力。在这类测试中，筛选步骤的时间和成本与文库大小无关，因此该方法可应用于相对较大的文库。含多达1012个成员的文库已经采用这类方法进行筛选。基于微滴的文库的开发也已经解决了这个问题，其可以通过微流体技术进行处理，将通量提高几个数量级(参见，例如，Clausell-Tormos等人，(2008)Chemistry&Biology15:427-437)。但是，基于选择的试验和基于微滴的筛选都需要能够容易地鉴定出所选择的化合物(即“命中物(hits)”)：可筛选的但不可解码的文库是无用的。在1992年，Brenner和Lerner(BrennerandLerner(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:5381-5383)首次提出解决这个问题的方案，该方案基于DNA编码化合物文库(DECL)的生成。在DECL中，每个化合物与对应于其结构或反应历史的DNA序列连接(标记)，由此作为该特定化合物的唯一标识符(即DNA标签“编码”该化合物，由此用作分子的“条形码”)。化合物可以采用多种不同的方式加标签(tagged)，并且还可能的是，使用DNA标签不仅可以编码特定的化合物结构(“DNA记录”)，还可以作为指导其合成的模板(“DNA模板”)。近年来，对这类技术有如下综述：Mannocci等，(2011)Chem.Commun.,47:12747-12753；Kleiner等，(2011)ChemSocRev.40(12)：5707-5717；Mullard(2016)Nature530:367-369对。DECL技术现在在制药行业已经很成熟：在2007年，GSK(葛兰素史克)以5500万美元收购了DECL的先驱之一Praecis制药(PraecisPharmaceuticals)，而其他排名前十的制药公司也开始了他们自己内部的DNA编码文库项目。包括X-Chem、Vipergen、EnsembleTherapeutics和Philochem在内的其他生物技术公司也在积极开发和利用DECL技术。但是目前，当前DECL的应用受到与标签存在及命中评估性质相关问题的限制，这仅通过结合活性来完成。例如，编码标签可能会：(a)在化学上或空间上干扰被标记化合物接近感兴趣的目标物上的分子结合位点，从而限制回收的命中物的数量和/或类型；(b)限制细胞渗透性和/或扩散性，有效地防止细胞吸收，并排除基于细胞表型的筛选的使用，该使用依赖于进入细胞质；(c)限制标记后化合物可以进行化学修饰的程度(某些反应在化学上与标签不相容)；以及(d)限制结构-活性分析的有用性，因为这种分析会被标签本身对活性的潜在影响所混淆，并且只检测到与靶结合的活性，而不是功能(例如酶)的活性。因此，需要新的HTS技术，其允许筛选可解码的化学文库并解决前述问题。
技术实现思路
根据本专利技术的第一方面，提供了一种经编码的化学文库的微珠，该微珠上或微珠内已固定有：(i)编码标签；和(ii)靶测试系统报告部分(targetassaysystemreportermoiety)，其中所述报告部分(reportermoiety)在不存在针对所述靶的活性的情况下以第一状态存在，并且在所述活性存在的情况下以第二状态存在，并且其中所述微珠进一步包含一个或多个化学结构的克隆群(clonalpopulation)，所述化学结构可释放地连接到所述标签并由所述标签编码。根据本专利技术的第二方面，提供了一种化学文库微区室，其包含水性溶剂和本专利技术的微珠。根据本专利技术的第三方面，提供了包括多个本专利技术的微区室的编码化学文库(ECL)，其中每个微区室包含不同的化学结构。根据本专利技术的第四方面，提供了一种用于筛选本专利技术的ECL中对靶具有活性的化学结构的方法，该方法包括以下步骤：(a)提供所述ECL；(b)从微珠中释放出所述化学结构，以产生多个游离的、无标签的化学结构(TCS)，这些化学结构溶解在溶剂中并与释放它们的微珠一起包含在微区室内，从而维持每个TCS和其编码标签之间的空间关联；(c)通过在以下条件下孵育步骤(b)的ECL微区室来测定TCS：通过对靶的活性水平来确定报告部分的状态，其中该报告部分被固定在微区室中的微珠上或微珠内；(d)通过打开微区室释放微珠；(e)通过确定所述报告部分的状态来筛选释放的微珠，从而可以通过对处于第二状态的具有报告部分的微珠的标签进行解码来鉴定对靶具有活性的化学结构。在下面列出的编号段落中定义和描述了本专利技术的其他方面、优选特征和优选可操作的组合。1.编码化学文库微珠，该微珠上和/或微珠内已经固定有：(i)编码标签；和(ii)靶测试系统报告部分，其中，所述报告部分在不存在针对靶的活性的情况下以第一状态存在，并且在所述活性存在的情况下以第二状态存在，并且其中所述微珠进一步包含一个或多个化学结构的克隆群，所述化学结构可释放地连接到所述标签并由所述标签编码。2.根据段落1所述的微珠，其中，所述编码标签还编码靶测试系统报告部分。3.根据段落1或段落2所述的微珠，其中，所述编码标签还编码所述靶。4.根据前述段落中任一项所述的微珠，其中，所述化学结构以每微珠1至1013个分子的负载存在。5.根据前述段落中任一项所述的微珠，其中，所述微珠包含多个化学结构的克隆群，任选地，其中所述编码标签还编码所述化学结构的负载。6.根据前述段落中任一项所述的微珠，其中，所述微珠上或微珠内已固定有多个靶测试系统报告部分，任选地，其中所述编码标签还编码报告部分的负载。7.根据段落6所述的微珠，其中，第一状态与第二状态的报告部分的比例与针对所述靶的活性水平相关。8.根据前述段落中任一项所述的微珠，其中，所述微珠基本上为球形。9.根据段落8所述的微珠，其中，所述微珠的直径最高达400μm。10.根据段落8所述的微珠，其中，所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.编码化学文库微珠，所述微珠上和/或微珠内已经固定有：(i)编码标签；和(ii)靶测试系统报告部分，其中，所述报告部分在不存在针对靶的活性的情况下以第一状态存在，并且在所述活性存在的情况下以第二状态存在，并且其中所述微珠进一步包含一个或多个化学结构的克隆群，所述化学结构可释放地连接到所述标签并由所述标签编码。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181024 GB 1817321.11.编码化学文库微珠，所述微珠上和/或微珠内已经固定有：(i)编码标签；和(ii)靶测试系统报告部分，其中，所述报告部分在不存在针对靶的活性的情况下以第一状态存在，并且在所述活性存在的情况下以第二状态存在，并且其中所述微珠进一步包含一个或多个化学结构的克隆群，所述化学结构可释放地连接到所述标签并由所述标签编码。


2.根据权利要求1所述的微珠，其中，所述编码标签还编码靶测试系统报告部分。


3.根据权利要求1或权利要求2所述的微珠，其中，所述编码标签还编码所述靶。


4.根据前述权利要求中任一项所述的微珠，其中，所述化学结构以每微珠1至1013个分子的负载存在。


5.根据前述权利要求中任一项所述的微珠，其中，所述微珠包含多个化学结构的克隆群，任选地，其中所述编码标签还编码所述化学结构的负载。


6.根据前述权利要求中任一项所述的微珠，其中，所述微珠上或微珠内已固定有多个靶测试系统报告部分，任选地，其中所述编码标签还编码报告部分的负载。


7.根据权利要求6所述的微珠，其中，第一状态与第二状态的报告部分的比例与针对所述靶的活性水平相关。


8.根据前述权利要求中任一项所述的微珠，其中，所述微珠基本上为球形。


9.根据权利要求8所述的微珠，其中，所述微珠的直径最高达400μm。


10.根据权利要求8所述的微珠，其中，所述微珠的直径为1-100μm。


11.根据权利要求8所述的微珠，其中，所述微珠的直径＜50μm。


12.根据前述权利要求中任一项所述的微珠，其中，所述微珠由水凝胶或聚合物形成。


13.根据权利要求12所述的微珠，其中，所述微珠由固体例如硅酮、聚合物例如聚苯乙烯、聚丙烯和二乙烯基苯或水凝胶形成，所述水凝胶例如选自琼脂糖、海藻酸盐、聚丙烯酰胺和聚乳酸。


14.根据前述权利要求中任一项所述的微珠，其中，所述编码标签包含核酸。


15.根据权利要求14所述的微珠，其中，所述核酸是DNA。


16.根据权利要求1-14中任一项所述的微珠，其中，所述微珠包含非DNA标签、非RNA标签、经修饰的核酸标签、肽标签、基于光的条形码(例如，量子点)、RFID标签、通过点击化学连接的报告化学物质和质谱-可解码标签。


17.根据前述权利要求中任一项所述的微珠，其中，所述化学结构是小分子。


18.根据前述权利要求中任一项所述的微珠，其中，所述化学结构通过可裂解的连接子可释放地连接至所述微珠。


19.根据权利要求18所述的微珠，其中，所述连接子是无疤痕型的，使得化学结构可以以其完全或基本上不含连接子残基的形式从所述微珠上裂解。


20.根据权利要求18或19所述的微珠，其中，所述可裂解的连接子包含选自以下的连接子：酶可裂解连接子；化学可裂解连接子；光可裂解连接子以及前述两种或两种以上的组合。


21.根据权利要求18-20中任一项所述的微珠，其中，所述可裂解的连接子选自：亲核试剂/碱敏感连接子；还原敏感连接子；紫外线敏感连接子；亲电试剂/酸敏感连接子；金属辅助型裂解敏感连接子；氧化敏感连接子；以及前述两种或两种以上的组合。


22.根据权利要求18-20中任一项所述的微珠，其中，所述可裂解的连接子是酶可裂解连接子，例如可被选自以下的酶裂解：蛋白酶(包括肠激酶)、核酸酶、硝基还原酶、磷酸酶、β-葡萄糖醛酸酶、溶酶体酶、TEV、胰蛋白酶、凝血酶、组织蛋白酶B、B和K、胱天蛋白酶、基质金属蛋白酶、磷酸二酯酶、磷脂酶、酯酶、还原酶和β-半乳糖苷酶的酶。


23.根据权利要求18-20中任一项所述的微珠，其中，所述可裂解的连接子包含RNA，并且其中所述化学结构可通过与核糖核酸酶接触而被释放。


24.根据权利要求18-20中任一项所述的微珠，其中，所述可裂解的连接子包含肽，并且其中所述化学结构可通过与肽酶接触而被释放。


25.根据权利要求18-20中任一项所述的微珠，其中，所述可裂解的连接子包含DNA，并且其中所述化学结构可通过与位点特异性核酸内切酶接触而被释放。


26.根据权利要求18-20中任一项所述的微珠，其中，所述可裂解的连接子是包含裂解部分和自脱落部分(SIM)的自脱落连接子，任选地，其中所述裂解部分是肽或非肽可酶裂解部分，例如Val-Cit-PAB。


27.根据前述权利要求中任一项所述的微珠，其中，所述化学结构间接地或直接地连接至所述微珠。


28.根据权利要求27所述的微珠，其中，所述化学结构经由所述编码标签间接地连接至所述微珠。


29.根据权利要求28所述的微珠，其中，所述化学结构通过核酸杂交连接至所述编码标签。


30.根据前述权利要求中任一项所述的微珠，其中，所述靶是酶，任选地是哺乳动物(例如人)、细菌酶或病毒酶，例如选自以下的酶：蛋白酶；激酶；脱氢酶和磷酸酶。


31.根据权利要求30所述的微珠，其中，所述靶测试系统报告部分是：(a)酶的底物、抑制剂、活化剂或分子伴侣；或(b)酶或其片段。


32.根据权利要求31所述的微珠，其中，所述靶测试系统报告部分包含：(a)酶的催化位点；和/或(b)酶的变构位点。


33.根据权利要求1-29中任一项所述的微珠，其中，所述靶是蛋白质，例如哺乳动物(例如人)、细菌或病毒蛋白。


34.根据权利要求33所述的微珠，其中，所述靶测试系统报告部分是：(a)所述蛋白质的结合伴侣；或(b)蛋白质或其片段。


35.根据权利要求1-29中任一项所述的微珠，其中，所述靶是受体，例如哺乳动物(例如人)、细菌或病毒蛋白。


36.根据权利要求35所述的微珠，其中，所述靶测试系统报告部分是：(a)所述受体的配体；或(b)受体或其片段。


37.根据权利要求1-29中任一项所述的微珠，其中，所述靶是受体配体。


38.根据权利要求37所述的微珠，其中，所述靶测试系统报告部分是：(a)所述受体配体或其片段；或(b)受体或其片段。


39.根据权利要求1-29中任一项所述的微珠，其中，所述靶是酶底物。


40.根据权利要求39所述的微珠，其中，所述靶测试系统报告部分是：(a)酶底物；或(b)酶或其片段。


41.根据权利要求1-29中任一项所述的微珠，其中，所述靶是分子伴侣。


42.根据权利要求41所述的微珠，其中，所述靶测试系统报告部分是：(a)所述分子伴侣或其片段；或(b)伴侣分子，例如分子伴侣结合肽。


43.根据权利要求1-29中任一项所述的微珠，其中，所述靶是毒素。


44.根据权利要求43所述的微珠，其中，所述靶测试系统报告部分是：(a)毒素或其片段；或(b)毒素的结合伴侣。


45.根据权利要求1-29中任一项所述的微珠，其中，所述靶是药物。


46.根据权利要求45所述的微珠，其中，所述靶测试系统报告部分是：(a)药物或其片段；或(b)药物的结合伴侣。


47.根据权利要求1-29中任一项所述的微珠，其中，所述靶测试系统报告部分被翻转，并且具有催化活性的化学结构可以通过解码具有处于翻转状态的报告部分的微珠的标签来鉴定。


48.根据权利要求1-29中任一项所述的微珠，其中，所述靶测试系统报告部分是荧光的，并且具有猝灭活性的化学结构可以通过解码具有处于猝灭状态的报告部分的微珠的标签来鉴定。


49.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：大卫·休·威廉姆斯，斯图尔特·罗伯特·伍德，妮古拉·汤普森，
申请(专利权)人：南纳治疗有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB