二聚的肽-磷脂缀合物的优化方法技术

本发明专利技术公开了制备式(I)的靶向KDR的肽‑磷脂缀合物的新的有效方法，其可用于治疗和诊断组合物，特别是可用于超声造影剂的制备中。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】二聚的肽-磷脂缀合物的优化方法专利
本专利技术涉及靶向KDR的肽-磷脂缀合物的领域，其可用于治疗和诊断组合物中，尤其涉及其制备方法。专利技术背景血管生成代表由先前存在的脉管系统形成新的血管，不仅在正常的生理过程中，而且在诸如癌症、类风湿性关节炎和糖尿病微血管疾病等疾病的发病机理中都起着至关重要的作用。例如，血管生成牵涉肿瘤从增生向肿瘤生长的转变。因此，抑制相关的病理过程在治疗和诊断癌症研究中非常重要。当产生超过血管生成抑制剂的血管生成生长因子时，刺激内皮细胞增殖。在已知的和特征最明确的促血管生成剂或生长因子中，血管内皮生长因子(VEGF)家族，尤其是KDR(激酶功能区受体，也称为VEGFR-2或Flk-1)代表更让人感兴趣的那些，它们表现出更丰富的内皮细胞表达并主导血管生成反应1。KDR的表达在新生血管中，特别是在肿瘤中高度上调，诱导强烈的血管生成反应2。体内KDR的VEGF结合活性对于血管生成至关重要，因此检测其在内皮细胞上调或检测VEGF/KDR结合复合物的能力在检测或监测血管生成中将非常有益。已知出于诊断和治疗目的，例如用于血管和内部器官的成像，将对目标靶标(例如KDR。)表现出高结合亲和力的任何靶向载体组合物掺入充气超声造影剂(gasfilledultrasoundcontrastagents)中将是特别有利的。例如，靶向KDR的肽-磷脂缀合物可用于制备靶向的充气超声造影剂。实际上，众所周知，充气超声造影剂是用于回波描记术的异常有效的超声反射器。例如，将充满气体的微气泡在载体液中的悬浮液注入生物体的血液中，将大大增强超声回波描记术成像，从而有助于内部解剖结构(如血管)的可视化。对靶KDR或VEGF/KDR复合物表现出高结合亲和力的一种靶向载体组合物例如由以下化合物(I)表示，其是一种首次描述在专利申请WO2007/067979A2中的缀合物“靶向肽-磷脂”(脂肽)，并且具有与表达KDR的组织结合的高能力。所述化合物(I)，在下文中且在图1中更详细地报道，在结构上由异二聚体肽构成，所述异二聚体肽由两个不同的单体肽链形成，所述两个不同的单体肽链均由23个氨基酸组成，并由戊二酰基连接基系连，并与聚乙二醇部分(PEG)，例如DSPE-PEG2000-NH2，通过第二个戊二酰基连接基缀合。WO2007/067979A2中描述了一种制备KDR结合肽-磷脂缀合物(I)的方法(有关详细信息，参见其中报道的实施例5，第52-54页和图4)。从肽单体的自动固相合成开始，然后使用戊二酸琥珀酰亚胺基酯(DSG)进行偶联和活化，然后经由戊二酰基连接基将获得的衍生物与DSPE-PEG2000-NH2偶联，来制备所述缀合物。以下方案1也说明了最后的偶联步骤。方案1从以上公开内容看来，偶联步骤可能暗示最终产物的产率和纯度方面的一些缺点(参见第[0063]段：“任何游离的磷脂都可能使最终产物的纯化和分离复杂化”)。实际上，相对于琥珀酰亚胺基-二肽(II)，默认情况下添加磷脂试剂DSPE-PEG2000-NH2(III)(其难以通过已知的纯化方法从最终产物(I)中分离出来)(DSPE-PEG2000-NH2与琥珀酰亚胺基二肽的比率：0.9到1当量)，以防止形成污染物和需要繁琐的纯化工作。然而，尽管该方法限制了最终产物中的杂质，但是导致昂贵的异二聚体(II)的损失并且使缀合步骤的产率不高于60％，或者甚至不高于30％。此外，如在WO2007/067979的实施例5中所公开的，在制备型HPLC纯化之后的最终化合物仍保留了几乎2％的杂质，其纯度特性不符合监管当局对药品的要求。已知方法的另一个缺点与高含量的三氟乙酸(TFA)的存在有关，在合成过程中添加三氟乙酸用于增溶以及在流动相中添加三氟乙酸用于制备型HPLC纯化。实际上，除了认为TFA是药学上不可接受的盐外，当产品以冻干形式在5℃或溶液中以TFA盐形式存储时，已观察到降解，该降解可能由TFA促进的二聚体缀合物中的一种磷脂脂肪酸酯的酸水解形成，从而提供了作为不希望的杂质的溶血化合物，如在WO2007/067979的[0065]-[0066]中所述。因此，必须进行进一步的繁琐且费时的程序以将“二聚体肽-磷脂缀合物的TFA盐转化为另一种更稳定的盐”。简而言之，已知方法的主要问题是在与聚乙二醇化的磷脂(III)的偶联步骤中昂贵的异二聚体(II)的有害损失；困难的纯化步骤损害了最终产物的纯度和收率；以TFA盐获得和储存的最终产物的不稳定性。因此，所公开的方法尽管相当有效，但是可能非常繁重并且还不代表有效的和工业上可应用的方法。纯度和生产效率参数尚未达到要求。相反，为了在血管和内部器官的成像中在体内使用这种靶向肽-磷脂缀合物，具有大规模生产高度纯化形式的所述产物的有效方法将是特别有益的。
技术实现思路
本专利技术提供了制备如上定义的肽-磷脂化合物(I)的新方法，其特征在于优化了偶联和纯化步骤的条件。该方法导致对于制造充气的超声造影剂特别有用。在此背景下，已经发现有效的分析程序显著改善了最终化合物与副产物的分离，从而允许在偶联过程中增加起始原料(III)的量并以更高的收率、最佳的纯度特性和合适的稳定特性获得化合物(I)，对于整个工艺过程的规模化进行很有用。因此，本专利技术的第一方面是制备化合物(I)或其药学上可接受的盐的方法，包括以下步骤(i)在DIEA存在下，将相应的琥珀酰亚胺酯中间体(II)与DSPE-PEG2000-NH2磷脂(III)偶联，其中所述磷脂(III)相对于化合物(II)过量存在。在一个优选的实施方案中，每当量化合物(II)用1.1或更多当量的磷脂(III)进行偶联。在一个更优选的实施方案中，每当量的化合物(II)用两当量的磷脂(III)进行偶联。在另一方面，本专利技术提供了所述方法，其进一步包括以下步骤：(ii)分离从步骤(i)的反应混合物中回收的粗产物(I)；(iii)任选地将步骤(ii)中获得的粗产物用水稀释，并加入碱以达到6至8的pH；和(iv)从步骤(iii)的溶液中纯化粗产物。在步骤(iii)中添加碱可以促进粗产物在水中的完全溶解，将溶液的pH保持6-8。优选地，添加适量的0.1NNaOH以达到6.5-7.5的pH，更优选达到pH7.3。根据本专利技术，步骤(iv)的纯化可以通过反相高效液相色谱法(RP-HPLC)或通过离子交换色谱法或通过RP-HPLC和离子交换色谱法两者来进行。在一个优选的实施方案中，纯化仅通过RP-HPLC纯化进行。根据本专利技术，优选通过使用pH为6-8并且包含易于除去的挥发性盐的洗脱剂来实现RP-HPLC的色谱分离。优化的流动相可以用例如由在水中的10mMAcONH4组成的洗脱剂A和在水/乙腈1/9中的10mMAcONH4组成的洗脱剂B的组合来代表。在另一个优选的实施方案中，通过离子交换色谱法进行纯本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.制备化合物(I)或其药学上可接受的盐的方法，/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181218 EP 18213539.21.制备化合物(I)或其药学上可接受的盐的方法，



包括以下步骤
(i)在DIEA存在下，将相应的琥珀酰亚胺酯中间体(II)与DSPE-PEG2000-NH2磷脂(III)偶联，






其中所述磷脂(III)相对于化合物(II)过量存在。


2.根据权利要求1的方法，其中所述偶联用每当量的化合物(II)1.1或更多当量的磷脂(III)进行。


3.根据权利要求1或2的方法，其中所述偶联用每当量的化合物(II)2当量的磷脂(III)进行。


4.根据权利要求1的方法，进一步包括以下步骤：
(ii)分离从步骤(i)的反应混合物中回收的粗产物(I)；
(iii)任选地将步骤(ii)中获得的粗产物用水稀释，并加入碱以达到6至8的pH；和
(iv)从步骤(iii)的溶液中纯化粗产物。


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【专利技术属性】
技术研发人员：A·克劳特，B·拉米，
申请(专利权)人：博莱科瑞士股份有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH