烟草多酚代谢途径蛋白基因NtPPOE及其应用制造技术

本发明专利技术涉及烟草多酚代谢途径蛋白基因NtPPOE及其应用，该基因碱基序列如SEQ ID NO.1所示。烟草多酚代谢途径NtPPOE由602个氨基酸残基组成，包括三个保守功能域：178‑388位第一个保守蛋白功能域，395‑445位其第二个保守蛋白功能域，466‑597为其第三个保守蛋白功能域。该蛋白基因NtPPOE与植物叶片中多酚中绿原酸含量高度负相关相关，降低该蛋白基因NtPPOE表达后，叶片中绿原酸含量显著升高。本发明专利技术通过对特定烟草多酚代谢途径蛋白基因NtPPOE的初步研究，发现其与绿原酸含量高度相关，在将该基因沉默后，烟草中绿原酸含量极显著升高。基于这一特性，可为烟叶中多酚类物质含量调控烟草新品种培育一定的应用基础和参考借鉴。

【技术实现步骤摘要】
烟草多酚代谢途径蛋白基因NtPPOE及其应用
本专利技术属于生物
，特别是属于烟草基因工程
，具体涉及烟草多酚代谢途径蛋白基因NtPPOE及其应用。
技术介绍
烟叶原料是卷烟工业的基础。近年来，我国烟叶原料生产整体水平有了明显的提高，但是烟叶原料质量距卷烟工艺配方的需要还有一定的差距，尤其香气品质不能满足工业企业的需求。香气优雅、风格突出的高档次烟叶还有很大需求空间。烤烟中多酚类化合物含量与品质存在一致性关系，多酚类化合物积累直接影响烤烟的外观质量和内在质量，有研究者提出将多酚物质含量与蛋白质氮含量比值作为“芳香值”，以此作为判断烟叶中香气吃味的数据标准，因此提高烟叶中多酚类物质含量对提升烟叶香气品质具有重要意义。烟叶多酚类物质含量很高，最多能达到干重的6％以上，其中绿原酸、莨菪亭和芸香苷是烟叶中含量最多的多酚类化合物，占烟草中多酚含量的80％以上，同时，仅仅绿原酸一种物质，就占到多酚的75-90％，因此，绿原酸是提高烟叶香气的一个重要潜在物质。然而多酚类物质属于次生代谢物，传统栽培技术措施无法对其含量进行有效调控。多酚在植物中受到多酚氧化酶(polyphenoloxidase，PPO)的基因调控，植物中的PPO基因多以基因家族形式存在(BeecherandSkinne，2001；Shettyetal.，2011；Arisasetal.，2012)。在茄科经济作物中，茄子中找到个6个PPO基因(Shetty，2011)；番茄中发现7个PPO基因；马铃薯中有2个PPO基因；红三叶草中找到至少6个PPO基因(Winters，2009)。Cai等(2013)发现高粱中存在8个不同的PPO基因；但葡萄藤中只发现一个PPO基因(Mayer，2006)。PPO活性具有植物组织差异性。PPO广泛存在于植物的多种器官中，如叶片、根、块茎及花中，幼嫩部位含量较高而在成熟部位含量较低(谢春艳和宾金华,1999)。马铃薯中PPO在块茎、根及花中含量较高，而在叶片中含量较低；PPO的活性随着块茎的发育不断升高(Thygesenetal.,1995)。PPO活性在烟草苗期活性较高；进入旺长期后，叶片中PPO活性继续升高；进入成熟期后，PPO活性逐渐下降；并且PPO活性呈现上部叶>中部叶>下部叶的规律(武德传etal.,2006)。PPO活性受到外界环境的调控(Thygesenetal.,1995；武德传etal.,2006；谢春艳和宾金华,1999)。嘎拉苹果多酚氧化酶反应的最适pH值为6.0，最适反应温度是45℃。Palma-Orozco(2012)从马曼果中分离出两种同工酶(PPO1和PPO2)，最适pH为7.0，最适温度是35℃。Rahman(2012)从花椰菜中分离出一种PPO，最适pH为8.0，最适温度为55℃。Han-Ju(2012)从油菜花中分离出的PPO最适pH为5.5，在60℃到70℃之间活性较为稳定。通过调控PPO类基因表达量而调节烟叶中多酚类物质含量是一种理论上可行，现实中急需的一种提高烟叶香气品质的有效技术手段。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种烟草多酚代谢途径蛋白基因NtPPOE及其应用，从而调节烟叶中多酚类物质含量，从而为高香气物质烟叶培育提供基础。本专利技术是通过以下技术方案实现的：烟草多酚代谢途径蛋白基因NtPPOE，其碱基序列如SEQIDNO.1所示。进一步的，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，由602个氨基酸残基组成，其中第178-388位、395-445位、466-597位氨基酸为保守的PPO结构域。进一步的，引物序列为：NtPPOE-F：5’-GTGTTGAAACAAATAATT-3’，NtPPOE-R：5’-GTACAAGTACCATCTATG-3’。进一步的，以烟草K326的cDNA为模板，以NtPPOE-F、NtPPOE-R为引物，进行PCR扩增。上述任一项烟草多酚代谢途径蛋白基因NtPPOE的应用，所述蛋白基因NtPPOE与植物叶片中多酚类物质含量相关。进一步的，利用基因沉默技术或者基因超表达方法，通过调节烟草中的蛋白基因NtPPOE表达量，来调节控制烟叶中多酚类物质含量。进一步的，通过转基因技术、瞬时表达技术或基因组编辑技术，构建含有蛋白基因NtPPOE的病毒诱导沉默载体、RNAi干涉载体、超表达载体或基因组编辑载体，转化烟草，筛选获得多酚类物质含量变化的烟草新品种。进一步的，利用病毒诱导的基因沉默技术，干扰蛋白基因NtPPOE的表达使其沉默，蛋白基因NtPPOE沉默植株中多酚类物质含量显著上升，进而获得叶片中多酚类物质含量升高的植物新品种。本专利技术的有益效果是：本专利技术通过对特定烟草多酚代谢途径蛋白基因NtPPOE的初步研究，发现其与绿原酸含量高度相关，在将该基因沉默后，烟草中多酚类物质含量发生了明显提高。基于这一特性，可为烟草高香气物质烟叶新品种培育提供一定的应用基础和参考借鉴。附图说明图1为本专利技术烟草TRV2-PDS、TRV2-GFP及TRV2-NtPPOE载体转化组的表型对比图；图2为与对照植株相比，蛋白基因NtPPOE沉默植株中该基因的相对表达量；图3为病毒诱导的基因沉默技术的烟叶及对照烟叶中的主要多酚类物质含量比较。具体实施方式以下通过实施例来对本专利技术的技术方案进行详细的说明，以下的实施例仅是示例性的，仅能用来解释和说明本专利技术的技术方案，而不能解释为是对本专利技术技术方案的限制。生物材料：本氏烟草，一种常用烟草材料，下述实施例中烟草种植于郑州烟草院种植基地，育苗钵中育苗，待发芽后两周进行分苗，种于塑料钵(10cm×10cm)中，22℃、16h光/8h暗条件下进行日常肥水管理等。下述实施例中所采用的VIGS载体是一种来自烟草脆裂病毒的病毒载体(tobaccorattlevirus，TRV)，所具体利用的TRV2由郑州烟草研究院基因中心保存，其带有卡那筛选标记和35S启动子，同时TRV2带有EcoRI和BamHI等多克隆位点，可以用来携带和转化外源基因。实验试剂：LB液体培养基，1L含量中含有：10g细菌蛋白胨(bacteriologicalpeptone)，10g氯化钠(NaCl)，5g酵母抽提物(yeastextract)，高温高压灭菌。YEB液体培养基，1L含量中含有：5g牛肉浸膏(beefextract)，5g细菌蛋白胨(bacteriologicalpeptone)，5g蔗糖(sucrose)，1g酵母抽提物(yeastextract)，2mL1M硫酸镁(MgSO4)，高温高压灭菌。1M2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)储备液：ddH2O溶解，过滤灭菌，-20℃储存备用。200mM乙酰丁香酮(Acetosyringone，As)储备液：二甲基亚砜(DSMO)溶解，-20℃储存备用；MMA(100mL)：1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.烟草多酚代谢途径蛋白基因NtPPOE，其特征在于，碱基序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.烟草多酚代谢途径蛋白基因NtPPOE，其特征在于，碱基序列如SEQIDNO.1所示。


2.根据权利要求1所述的烟草多酚代谢途径蛋白基因NtPPOE，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，由602个氨基酸残基组成，其中第178-388位、395-445位、466-597位氨基酸为保守的PPO结构域。


3.根据权利要求1所述的烟草多酚代谢途径蛋白基因NtPPOE，其特征在于，引物序列为：
NtPPOE-F：5’-GTGTTGAAACAAATAATT-3’，
NtPPOE-R：5’-GTACAAGTACCATCTATG-3’。


4.根据权利要求3所述的烟草多酚代谢途径蛋白基因NtPPOE，其特征在于，以烟草K326的cDNA为模板，以NtPPOE-F、NtPPOE-R为引物，进行PCR扩增。


5.上述权利要求1至4中任一项烟草多酚代谢途径蛋白基因N...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨永锋，王根发，刘向真，刘茂林，姚倩，赵森森，马波波，刘超，王燃，金立锋，
申请(专利权)人：河南中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：河南;41