一种只包含Cu的SOD基因及编码的蛋白质和其应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种只包含Cu的SOD基因及编码的蛋白质和其应用。所述基因来源于中华稻蝗，命名为Cu‑only SOD基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示的序列，其编码的蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示的序列，该蛋白质为超氧化物歧化酶。本发明专利技术通过基因克隆技术克隆出该基因序列，基于其氨基酸序列对该蛋白的空间结构进行模拟，发现该蛋白中缺少Zn原子，只包含一个Cu原子，这是首次报道的存在于细胞内的Cu‑only SOD。利用基因工程技术构建原核表达载体并进行蛋白的分离纯化，在体外对其功能进行研究，发现该蛋白具有抗氧化功能。

【技术实现步骤摘要】
一种只包含Cu的SOD基因及编码的蛋白质和其应用
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种只包含Cu的SOD基因及编码的蛋白质和其应用。
技术介绍
超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase，SOD)是一种广泛存在于生物体内的金属蛋白酶，它能够清除生物氧化过程中产生的超氧阴离子自由基(·O2-)，是生物体有效清除活性氧的重要抗氧化酶类之一，被称为生物体抗氧化系统的第一道防线。研究发现，SOD在人体的衰老和死亡中发挥着重要作用，有很多疾病的发生与发展均与SOD密切相关，补充SOD可以达到预防和治疗各种疾病、延缓衰老的目的。SOD在多种环境胁迫中发挥着重要的生物学功能，如抵抗重金属、化学污染物、温度、水分、盐分、辐射等产生的氧化胁迫。SOD被广泛地应用于食品、化妆品、日用品、疾病治疗等多方面，因此，SOD在生物抗氧化中的作用越来越受到重视。SOD根据与其结合且发挥作用的金属离子的种类，可分为CuZnSOD、MnSOD、FeSOD和NiSOD四大类。CuZnSOD由两个相同的亚基组成，亚基之间通过非共价的疏水作用来相互缔合，肽链内部形成的分子内二硫键对亚基缔合起着重要的作用。每个亚基活性中心包括一个Cu原子和一个Zn原子，Cu参与电子传递，它的存在是CuZnSOD活性所必须的，而Zn与保持酶活性中心构象相关，不直接与超氧阴离子自由基作用，起到稳定活性中心周围环境的作用。近年来，越来越多的CuZnSOD基因及其编码的蛋白质被发现，但是，只包含Cu的SOD基因较少。本专利技术在中华稻蝗中发现了一种只包含Cu的SOD基因及其蛋白质。该蛋白是否仍具有清除自由基的功能，本专利技术运用基因工程技术体外表达并分离纯化该蛋白质，对其功能进行了研究，发现该蛋白具有抗氧化功能。
技术实现思路
针对上述问题本专利技术提供了一种只包含Cu的SOD基因及编码的蛋白质和其应用。为了达到上述目的，本专利技术采用了下列技术方案：本专利技术提供的只包含Cu的SOD基因来源于中华稻蝗，其名称为Cu-onlySOD，所述Cu-onlySOD的基因序列如SEQIDNO:1所示。该基因序列以中华稻蝗cDNA为模板，通过简并引物获得部分片段，接着通过RACE-PCR方法获得全长，最后利用特异引物进行PCR扩增、克隆测序验证全长序列。一种由上述Cu-onlySOD基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示，该蛋白质为超氧化物歧化酶，具有抗氧化的功能。一种含有上述Cu-onlySOD基因的载体，所述载体为原核细胞表达载体。进一步，所述原核细胞表达载体为pColdI表达载体。一种含有上述Cu-onlySOD基因的基因工程细胞，所述基因工程细胞为大肠杆菌细胞。一种上述Cu-onlySOD基因编码的蛋白质的应用，应用在制备自由基清除的产品。与现有技术相比本专利技术具有以下优点：CuZnSOD由两个相同的亚基组成，每个亚基活性中心包括一个Cu原子和一个Zn原子。本专利技术在中华稻蝗体内发现一种只包含Cu的SOD基因及其蛋白质，该蛋白缺少Zn原子，只包含一个Cu原子。功能研究发现该蛋白具有抗氧化活性。此蛋白为细胞内Cu-onlySOD，未在任何物种中报道过只包含Cu的细胞内SOD。本专利技术只包含Cu的SOD具有抗氧化功能及SOD特性，能够被应用到医药、食品、化妆品、保健品等行业，具有广阔的市场应用前景。附图说明图1为实施例1中Cu-onlySOD基因引物设计；图2为实施例1中Cu-onlySOD基因全长验证的PCR产物凝胶电泳图；图3为实施例1中Cu-onlySOD基因翻译后氨基酸序列的一级结构示意图；图4为实施例2中Cu-onlySOD蛋白空间结构模拟图；图5为实施例5中Cu-onlySOD蛋白的功能验证图。具体实施方式实施例1：中华稻蝗Cu-onlySOD基因序列获得1、中华稻蝗Cu-onlySOD基因保守区序列获得根据已公布的其它昆虫物种的CuZnSOD基因序列设计简并引物，位置、长度如图1所示，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，其引物的序列如下所示：上游引物序列如SEQIDNO：3所示：TTYCAYGTNCAYGARTTYGG；下游引物序列如SEQIDNO：4所示：CKNGCNCCNGCRTTNCC；选取活力良好、大小均匀的中华稻蝗5龄若虫雌雄虫各5头(田间采集4龄若虫实验室内饲养到5龄若虫)，迅速于液氮中冷冻，于-80℃中低温保存。根据Trizol试剂盒(TaKaRa公司)说明书的方法提取中华稻蝗整虫的总RNA。采用M-MLV反转录酶(TaKaRa公司)将总RNA反转录成cDNA。以此为模板，利用已合成的简并引物(图1)，通过PCR扩增仪进行PCR扩增，并连接、转化、测序，获得Cu-onlySOD基因的保守区序列片段。2、中华稻蝗Cu-onlySOD基因5’和3’序列获得根据已获得的保守区片段设计3’和5’RACE特异引物(图1)，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，其引物序列如下所示：上游引物序列如SEQIDNO：5所示：AGACCACAACGTCATTGGCCGCAC；下游引物序列如SEQIDNO：6所示：TTCCCAGGTCGTCAGGGTCA；根据mRNAIsolationSystems试剂盒(Promega公司)说明书分离mRNA。根据SMARTTMRACEcDNAAmplificationkit(Promega公司)说明书合成5’和3’-RACE-ReadycDNA。按照2Polymerase(Promega公司)说明书的扩增反应体系和反应条件进行Cu-onlySOD基因5’和3’末端cDNA序列的扩增，并连接、转化、测序，获得Cu-onlySOD基因的5’和3’端序列。3、中华稻蝗Cu-onlySOD基因全长序列验证对已获得的Cu-onlySOD基因的保守区序列、5’和3’端序列进行拼接，然后设计验证全长序列的特异引物，其序列如下所示：上游引物序列如SEQIDNO：7所示：TTATATTTCAGACATGACTATYAAAGCAG；下游引物序列如SEQIDNO：8所示：CGCCTTCATGCCTTGGCAATGCCGATCA；通过PCR扩增仪进行PCR扩增，凝胶电泳检测(图2)，然后连接、转化、测序，验证Cu-onlySOD基因的全长序列，其序列为SEQIDNO:1。利用ExPASy-Translatetool(https://www.expasy.org/translate)将中华稻蝗Cu-onlySOD基因序列翻译成氨基酸序列，其序列为SEQIDNO:2，该基因编码131个氨基酸。Cu-onlySOD蛋白的特征序列和N-糖基化位点分别利用PROSITE数据库(http://prosite.expasy.org/scanpros本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种只包含Cu的SOD基因，其特征在于，所述基因来源于中华稻蝗，其序列如SEQ IDNO：1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种只包含Cu的SOD基因，其特征在于，所述基因来源于中华稻蝗，其序列如SEQIDNO：1所示。


2.一种由权利要求1所述基因编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示，该蛋白质为超氧化物歧化酶。


3.一种含有权利要求1所述基因的载体，其特征在于，所述载体为原核...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴海花，刘静，张学尧，张建珍，马恩波，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：山西;14