一种突变酶CYP153A M228L及其在合成10-羟基-2-癸烯酸中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种突变酶CYP153A M228L及其在合成10‑羟基‑2‑癸烯酸中的应用，具体涉及的突变酶CYP153A M228L是将CYP153A酶第228位的氨基酸由M突变为L；以癸酸为原料两步法生物合成10‑羟基‑2‑癸烯酸的方法，主要包括构建优化后重组质粒pCDFDuet‑1‑MaMACS‑PpFadE、优化后重组质粒pET21b‑CYP153A M228L‑CPR

【技术实现步骤摘要】
一种突变酶CYP153AM228L及其在合成10-羟基-2-癸烯酸中的应用
本专利技术涉及一种突变酶CYP153AM228L及其在合成10-羟基-2-癸烯酸中的应用，属于生物发酵

技术介绍
10-羟基-2-癸烯酸(10-hydroxy-2-decenoicacid，10-HDA)是一种含有羟基的单不饱和脂肪酸，分子式为C10H18O3。迄今为止，自然界中仅从蜂王浆及蜂胶中发现，因此又称王浆酸。研究表明10-HDA具有抗菌、免疫调节及抗氧化，抗肿瘤，降低血糖等多种重要的生理功能，具有极高的医药和保健价值，应用前景十分广泛。该化合物结构如下：鉴于10-HDA广泛而重要的应用价值，寻找10-HDA高效方便、低成本生产方法的研究被广泛重视。目前10-HDA的获得方法主要有物理提取法、化学合成法。其中物理提取法来源单一，蜂王浆中10-HDA含量仅为1.4％-2.4％，因此产量小，无法满足市场需求。而化学合成法虽然可以满足产业需求，但其操作步骤较冗繁，且化学试剂具有一定的毒性。因而探索10-HDA高效方便、低成本的合成方法，对其大规模开发和利用具有重要的理论和应用价值。近年来微生物发酵合成法生产10-HDA已经成为研究者及该行业的新目标。中国专利文献CN109897870A(申请号：201910088897.0)公开了一种以癸酸为原料利用大肠杆菌工程菌制备10-羟基-2癸烯酸的方法，该专利文献利用癸酸一步生成10-HDA。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种突变酶CYP153AM228L及其在合成10-羟基-2-癸烯酸中的应用。本申请利用两步法生成10-HDA，且本申请利用的脂酰CoA脱氢酶基因PpFadE、脂酰CoA合成酶基因MaMACS、酰辅酶A硫酯酶基因ctydiI与中国专利文献CN109897870A(申请号：201910088897.0)中脂酰CoA脱氢酶基因MCAD、脂酰CoA合成酶基因FadK、酰辅酶A硫酯酶基因ydiI并非相同基因，本申请中的烷烃羟化酶CYP153A是将228位的氨基酸由M变为L。本专利技术针对现有单独一个工程菌构建的合成途径，10-HDA合成效率极低，不能达到工业化水平的情况下，本专利技术在前期研究的基础上，进一步优化表达元件及10-HDA合成途径，提供一种两步法以癸酸为原料利用大肠杆菌工程菌生产制备10-羟基-2-癸烯酸的方法。本专利技术的技术方案如下：一种烷烃羟化酶CYP153A突变酶CYP153AM228L的编码基因核苷酸序列如SEQIDNO.23所示。一种烷烃羟化酶CYP153A突变酶CYP153AM228L的氨基酸序列如SEQIDNO.24所示。一种重组表达载体包含上述突变酶的编码基因。一种重组菌株包含上述突变酶的编码基因。上述突变酶的编码基因、重组表达载体或重组表达菌株在制备突变酶CYP153AM228L的应用。上述突变酶CYP153AM228L在制备10-羟基-2-癸烯酸中的应用。一种大肠杆菌基因缺失菌BL21ΔFadB、R、J，所述大肠杆菌基因缺失菌种为大肠杆菌BL21中敲除了FadB基因、FadR基因和FadJ基因得到。所述Δ符号为从大肠的基因组上敲除了某个基因，FadB为烯酰CoA水合酶，FadR是一种蛋白操纵子，FadJ为3-羟酰辅酶A脱氢酶；这三种酶的存在对本专利技术的两步法催化癸酸产10-HDA起阻碍作用，所以敲除了。大肠杆菌基因缺失菌BL21ΔFadB、R、J在制备10-羟基-2-癸烯酸中的应用。上述大肠杆菌基因缺失菌BL21ΔFadB、R、J的构建方法，包括如下步骤：Ⅰ利用RED重组法敲除基因，构建基因缺失ΔFadRB菌种(以下称为ΔFadRΔFadB菌种)；该菌种的构建方法参见中国专利文献CN110684794A；Ⅱ利用RED重组法敲除基因，构建大肠杆菌基因缺失菌BL21ΔFadB、R、J，具体包括构建FadJ敲除框(以下将FadJ敲除框缩写为Jk)；将FadJ敲除框转化进pkd46-ΔFadRΔFadB感受态细胞中，制得大肠杆菌基因缺失菌BL21ΔFadB、R、J。根据本专利技术优选的，步骤Ⅱ中构建FadR敲除框，包括如下步骤：以大肠杆菌BL21基因组为模板，扩增3-羟酰辅酶A脱氢酶基因的上游同源臂FadJ1，上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.25所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.26所示；以大肠杆菌BL21基因组为模板，扩增3-羟酰辅酶A脱氢酶基因的下游同源臂FadJ2，上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.27所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.28所示；以pkd3质粒为模板，扩增FRT-RKan—FRT基因片段，上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.29所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.30所示；然后将FadJl、FRT-RKan-FRT与FadJ2基因片段多片段无缝克隆，扩增FadJ1-Kan-FadJ2的敲除框片段，上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.31所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.32所示，纯化胶回收获得FadJ敲除框(以下将FadJ敲除框缩写为Jk)。进一步优选的，PCR扩增体系如下，总体系50μL：100μM上游引物2.0μL，100μM下游引物2.0μL，模板2.0μL，5U/μLphanta酶25μL，ddH2O19μL；PCR扩增条件如下：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1min15s，循环30次；72℃延伸5min。根据本专利技术优选的，步骤Ⅱ中FadJ敲除框转化入pkd46-ΔFadRΔFadB重组菌，最终获得大肠杆菌基因缺失菌BL21ΔFadB、R、J，包括如下步骤：a、将质粒pkd46转化进ΔFadRΔFadB感受态细胞中，获得的pkd46-ΔFadRΔFadB重组菌，制备pkd46-ΔFadRΔFadB感受态细胞，再用质量浓度为10％的甘油保存制备的pkd46-ΔFadRΔFadB感受态细胞；b、将FadJ敲除框Jk转化进pkd46-ΔFadRΔFadB感受态细胞中，验证pkd46-Jk-BL21重组菌确认敲除框转入后，42℃消除pkd46，筛选后得到Jk-ΔFadRΔFadB重组菌；c、将Jk-ΔFadRΔFadB重组菌制备感受态转化pcp20质粒，42℃消除Jk抗性以及pcp20质粒，获得ΔFadRBJ重组菌，即为大肠杆菌基因缺失菌BL21ΔFadB、R、J。一种以癸酸为原料利用大肠杆菌工程菌静息细胞制备10-羟基-2-癸烯酸的方法，包括如下步骤：(1)构建优化后重组质粒pCDFDuet-1-MaMACS-PpFadE、优化后重组质粒pET21b-CYP153AM228L-CPRBM3、优化后重组质粒pET28a-SUMO-ctYdiI；所述CYP153A-CPRBM3融合酶的表达基因核苷酸序列如SEQI本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种烷烃羟化酶CYP153A突变酶CYP153A M228L的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO23所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种烷烃羟化酶CYP153A突变酶CYP153AM228L的编码基因核苷酸序列如SEQIDNO23所示。


2.一种烷烃羟化酶CYP153A突变酶CYP153AM228L的氨基酸序列如SEQIDNO24所示。


3.一种重组表达载体包含权利要求1所述突变酶的编码基因。


4.一种重组菌株包含权利要求1所述突变酶的编码基因。


5.权利要求1所述突变酶的编码基因、权利要求3所述重组表达载体或权利要求4所述重组表达菌株在制备突变酶CYP153AM228L的应用。


6.权利要求1或权利要求2所述突变酶CYP153AM228L在制备10-羟基-2-癸烯酸中的应用。


7.一种大肠杆菌基因缺失菌BL21ΔFadB、R、J，其特征在于，所述大肠杆菌基因缺失菌种为大肠杆菌BL21中敲除了FadB基因、FadR基因和FadJ基因得到。


8.权利要求7所述大肠杆菌基因缺失菌BL21ΔFadB、R、J在制备10-羟基-2-癸烯酸中的应用。


9.权利要求7所述大肠杆菌基因缺失菌BL21ΔFadB、R、J的构建方法，包括如下步骤：
Ⅰ利用RED重组法敲除基因，构建基因缺失ΔFadRB菌种(以下称为ΔFadRΔFadB菌种)；该菌种的构建方法参见中国专利文献CN110684794A；
Ⅱ利用RED重组法敲除基因，构建大肠杆菌基因缺失菌BL21ΔFadB、R、J，具体包括构建FadJ敲除框(以下将FadJ敲除框缩写为Jk)；将FadJ敲除框转化进pkd46-ΔFadRΔFadB感受态细胞中，制得大肠杆菌基因缺失菌BL21ΔFadB、R、J；
优选的，步骤Ⅱ中构建FadR敲除框，包括如下步骤：
以大肠杆菌BL21基因组为模板，扩增3-羟酰辅酶A脱氢酶基因的上游同源臂FadJ1，上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.25所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.26所示；以大肠杆菌BL21基因组为模板，扩增3-羟酰辅酶A脱氢酶基因的下游同源臂FadJ2，上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.27所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.28所示；以pkd3质粒为模板，扩增FRT-RKan—FRT基因片段，上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.29所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.30所示；然后将FadJl、FRT-RKan-FRT与FadJ2基因片段多片段无缝克隆，扩增FadJ1-Kan-FadJ2的敲除框片段，上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.31所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.32所示，纯化胶回收获得FadJ敲除框(以下将FadJ敲除框缩写为Jk)
优选的，PCR扩增体系如下，总体系50μL：
100μM上游引物2.0μL，100μM下游引物2.0μL，模板2.0μL，5U/μLphanta酶25μL，ddH2O19μL；
PCR扩增条件如下：
95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1min15s，循环30次；72℃延伸5min
优选的，步骤Ⅱ中FadJ敲除框转化入pkd46-ΔFadRΔFadB重组菌，最终获得大肠杆菌基因缺失菌BL21ΔFadB、R、J，包括如下步骤：
a、将质粒pkd46转化进ΔFadRΔFadB感受态细胞中，获得的pkd46-ΔFadRΔFadB重组菌，制备pkd46-ΔFadRΔFadB感受态细胞，再用质量浓度为10％的甘油保存制备的pkd46-ΔFadRΔFadB感受态细胞；
b、将FadJ敲除框Jk转化进pkd46-ΔFadRΔFadB感受态细胞中，验证pkd46-Jk-BL21重组菌确认敲除框转入后，42℃消除pkd46，筛选后得到Jk-ΔFadRΔFadB重组菌；
c、将Jk-ΔFadRΔFadB重组菌制备感受态转化pcp20质粒，42℃消除Jk抗性以及pcp20质粒，获得ΔFadRBJ重组菌，即为大肠杆菌基因缺失菌BL21ΔFadB、R、J。


10.一种以癸酸为原料利用大肠杆菌工程菌静息细胞制备10-羟基-2-癸烯酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)构建优化后重组质粒pCDFDuet-1-MaMACS-PpFadE、优化后重组质粒pET21b-CYP153AM228L-CPRBM3、优化后重组质粒pET28a-SUMO-ctYdiI；
所述CYP153A-CPRBM3融合酶的表达基因核苷酸序列如SEQIDNO.13所示；CYP153AM228L-CPRBM3融合酶的表达基因核苷酸序列如SEQIDNO.14所示；脂酰CoA合成酶基因MaMACS的核苷酸序列如SEQIDNO.15所示；脂酰CoA脱氢酶基因PpFadE的核苷酸序列如SEQIDNO.16所示；酯酰辅酶A硫酯酶基因ctYdiI的核苷酸序列如SEQIDNO.17所示；
(2)利用步骤(1)制得的重组质粒pCDFDuet-1-MaMACS-PpFadE、pET28a-SUMO-ctYdiI转化到的大肠杆菌敲除菌种，构建大肠杆菌BL21ΔFadB、R、J，pCDFDuet-1-MaMACS-PpFadE、pET28a-SUMO-ctYdiI，将重组质粒pET21b-CYP153AM228L-CPRBM3转化到大肠杆菌BL21中，构建大肠杆菌BL21pET21b-CYP153AM228L-CPRBM3，两种工程菌经筛选，诱导培养，制得诱导细胞；
(3)将步骤(2)制得的诱导细胞经转化培养基培养，制得静息细胞，然后向大肠杆菌BL21ΔFadB、R、J，pCDFDuet-1-MaMACS-PpFadE、pET28a-SUMO-ctYdiI静息细胞中加入癸酸培养制得反式-2-癸烯酸；将反应液中加入大肠杆菌BL21pET21b-CYP153AM228L-CPRBM3静息细胞，培养制得10-羟基-2-癸烯酸；
优选的，所述步骤(1)中，构建重组质粒pET21b-CYP153A-CPRBM3，包括如下步骤：
以经过密码子优化的海杆菌(Marinobacteraquaeolei)的烷烃羟化酶CYP153A与巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)P450NADH还原酶CPRBM3的融合酶基因为模板进行PCR扩增，CYP153A的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，CPRBM3的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，然后将pET21b质粒用NdeI和XhoI进行双酶切，...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏静，李岩，王瑞明，王丽，王蕾蕾，徐子淇，汪俊卿，刘孟连，宋子昂，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37