本发明专利技术公开了丹参中丹参酮IIA合酶的基因及其编码蛋白，以及用于生产或提高丹参酮IIA含量的方法。本发明专利技术基因是首次从丹参等多种植物中克隆得到，所编码的蛋白能够催化隐丹参酮合成丹参酮IIA，也可以催化异隐丹参酮合成异丹参酮IIA。因此本发明专利技术在生产有效的活性物质方面具有应用价值，为大规模生产丹参酮ⅡA提供新的途径，也为工业生产其他相关的丹参酮类化合物奠定了坚实的基础。
【技术实现步骤摘要】
丹参酮ⅡA合酶基因及应用
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及药用植物基因工程领域，更具体涉及参与丹参酮类化合物合成途径的基因及其应用。
技术介绍
丹参(SalviamiltiorrhizaBunge)隶属唇形科(Lamiaceae)，是传统药用植物，以根和根茎入药，广泛用于治疗心脑血管及相关疾病。丹参的药用成分主要包括两类：一类是脂溶性的二萜丹参酮类化合物，另一类是水溶性的多聚酚酸类化合物。二萜丹参酮类化合物具有较强的生物活性，在丹参中含量较高。近年来对于丹参酮类的生物合成及调控研究不断获得新的进展，丹参酮类的开发利用更具有广阔的开发潜力。丹参酮类生物合成途径的研究对遗传育种以及合成生物学的开发具有重要的指导意义。目前丹参酮类生物合成途径的研究，除了催化GGPP生成次丹参酮二烯的CPS和KSL，多个细胞色素P450酶(CytochromeP450，CYP450)也被鉴定，包括CYP76AH1、CYP76AH3和CYP76AK1等，分别催化次丹参酮二烯生成铁锈醇及其羟基化的丹参酮类中间产物(GuoJ,MaX,CaiY,MaY,ZhanZ,ZhouYJ,LiuW,GuanM,YangJ,CuiG,KangL,YangL,ShenY,TangJ,LinH,MaX,JinB,LiuZ,PetersRJ,ZhaoZK,HuangL(2016)CytochromeP450promiscuityleadstoabifurcatingbiosyntheticpathwayfortanshinones.NewPhytol210(2):525-534.doi:10.1111/nph.13790；GuoJ,ZhouYJ,HillwigML,ShenY,YangL,WangY,ZhangX,LiuW,PetersRJ,ChenX,ZhaoZK,HuangL(2013)CYP76AH1catalyzesturnoverofmiltiradieneintanshinonesbiosynthesisandenablesheterologousproductionofferruginolinyeasts.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica110(29):12108-12113.doi:10.1073/pnas.1218061110)。最近又有三个CYP71D家族蛋白CYP71D375、CYP71D373和CYP71D411被证明参与了丹参酮的生物合成途径，其中CYP71D375催化合成隐丹参酮(MaY,CuiG,ChenT,MaX,WangR,JinB,YangJ,KangL,TangJ,LaiC,WangY,ZhaoY,ShenY,ZengW,PetersRJ,QiX,GuoJ,HuangL(2021)ExpansionwithintheCYP71DsubfamilydrivestheheterocyclizationoftanshinonessynthesisinSalviamiltiorrhiza.Naturecommunications12(1):685.doi:10.1038/s41467-021-20959-1)。在丹参的二萜化合物中，丹参酮ⅡA是最重要的活性成分之一。丹参酮ⅡA磺酸钠作为药物已经被广泛应用，对心脑血管疾病、肝脏损伤等多种疾病均具有活性，最新研究表明丹参酮ⅡA可通过降低外膜肥大细胞活性缓解动脉粥样硬化(MeimX-D,CaoY-F,CheY-Y,LiJ,ShangZ-P,ZhaoW-J,QiaoY-J,ZhangJ-Y(2019)Danshen:aphytochemicalandpharmacologicaloverview.ChineseJournalofNaturalMedicines17(1):59-80.doi:10.1016/s1875-5364(19)30010-x；ParkYK,Obiang-ObounouBW,LeeJ,LeeTY,BaeMA,HwangKS,LeeKB,ChoiJS,JangBC(2017)Anti-AdipogenicEffectson3T3-L1CellsandZebrafishbyTanshinoneIIA.Internationaljournalofmolecularsciences18(10).doi:10.3390/ijms18102065)，但迄今催化丹参酮ⅡA合成的催化酶仍不清楚。
技术实现思路
在本专利技术首次公开一种丹参酮ⅡA合酶基因及其编码蛋白，具体是从丹参等多种植物中克隆到一种丹参酮ⅡA合酶基因，并研究解析丹参酮ⅡA的合成途径，同时预测该基因在丹参酮ⅡA积累过程的重要作用。本专利技术涉及的丹参TⅡAS基因在植物如丹参和微生物体内，以及体外验证了上述功能。本专利技术提供一种丹参酮ⅡA合酶的基因TⅡAS，其核苷酸序列如下之一：1)SEQIDNo.1、SEQIDNo.3、SEQIDNo.5、SEQIDNo.7、SEQIDNo.9、SEQIDNo.11、SEQIDNo.13、SEQIDNo.15所示的核苷酸序列；2)由SEQIDNo.1通过一个或几个核苷酸的添加、删除、取代而得到的序列，编码的蛋白质仍具有丹参酮ⅡA合酶的活性。3)核苷酸序列一致性与SEQIDNo.1达到80％以上、85％以上或90％以上，或95％以上，或99％以上的同源基因，编码的蛋白质仍具有丹参酮ⅡA合酶活性；优选地，来源于丹参、南丹参、美丽鼠尾草、三叶鼠尾草、红根草、甘西鼠尾草、毛地黄鼠尾草和佛光草。更优选地，所述的丹参酮ⅡA合酶基因为SEQIDNo.1、SEQIDNo.3、SEQIDNo.5、SEQIDNo.7、SEQIDNo.9、SEQIDNo.11、SEQIDNo.13、SEQIDNo.15所示的核苷酸序列。进而，本专利技术提供一种由所述的基因TⅡAS编码的蛋白质。具体地，所述的蛋白质的氨基酸序列一致性与SEQIDNo.2达到80％以上、85％以上或90％以上、95％以上或99％以上的同源蛋白，且仍具有丹参酮ⅡA合酶的活性。优选地，其来源于丹参、南丹参、美丽鼠尾草、三叶鼠尾草、红根草、甘西鼠尾草、毛地黄鼠尾草和佛光草，更优选地氨基酸序列如SEQIDNo.2、SEQIDNo.4、SEQIDNo.6、SEQIDNo.8、SEQIDNo.10、SEQIDNo.12、SEQIDNo.14、SEQIDNo.16所示。本专利技术还提供含有所述的基因TⅡAS的重组载体，优选为表达载体，更具体为细菌、真菌或植物表达载体，更进一步为大肠杆菌、酵母表达载体。进一步提供含有所述的基因TⅡAS或所述重组载体的宿主细胞，更具体为细菌、真菌或植物细胞，更进一步为大肠杆菌、酵母细胞。本专利技术尤其提供含有所述的基因TⅡAS或所述的蛋白质在生产或制备丹参酮ⅡA或异丹参酮ⅡA中的应用。更进一步地，本专利技术提供利用微生物发酵催化隐丹参酮生成丹参酮ⅡA，或催化异隐丹参酮生成异丹参酮ⅡA的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.丹参酮ⅡA合酶的基因TⅡAS，其核苷酸序列如下之一：/n1)SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ IDNo.11、SEQ ID No.13、SEQ ID No.15所示的核苷酸序列；/n2)由SEQ ID No.1通过一个或几个核苷酸的添加、删除、取代而得到的序列，编码的蛋白质仍具有丹参酮ⅡA合酶的活性；/n3)核苷酸序列一致性与SEQ ID No.1达到80％以上、85％以上、90％以上，95％以上或99％以上的同源基因，编码的蛋白质仍具有丹参酮ⅡA合酶的活性；优选地，来源于丹参、南丹参、美丽鼠尾草、三叶鼠尾草、红根草、甘西鼠尾草、毛地黄鼠尾草和佛光草。/n
【技术特征摘要】
1.丹参酮ⅡA合酶的基因TⅡAS，其核苷酸序列如下之一：
1)SEQIDNo.1、SEQIDNo.3、SEQIDNo.5、SEQIDNo.7、SEQIDNo.9、SEQIDNo.11、SEQIDNo.13、SEQIDNo.15所示的核苷酸序列；
2)由SEQIDNo.1通过一个或几个核苷酸的添加、删除、取代而得到的序列，编码的蛋白质仍具有丹参酮ⅡA合酶的活性；
3)核苷酸序列一致性与SEQIDNo.1达到80％以上、85％以上、90％以上，95％以上或99％以上的同源基因，编码的蛋白质仍具有丹参酮ⅡA合酶的活性；优选地，来源于丹参、南丹参、美丽鼠尾草、三叶鼠尾草、红根草、甘西鼠尾草、毛地黄鼠尾草和佛光草。
2.根据权利要求1所述的基因TⅡAS，其特征在于：所述的丹参酮ⅡA合酶基因为SEQIDNo.1、SEQIDNo.3、SEQIDNo.5、SEQIDNo.7、SEQIDNo.9、SEQIDNo.11、SEQIDNo.13、SEQIDNo.15所示的核苷酸序列。
3.一种由权利要求1或2所述的基因TⅡAS编码的蛋白质。
4.根据权利要求3所述的蛋白质，其特征在于：氨基酸序列为与SEQIDNo.2达到80％以上、85％以上、90％以上、95％以上或99％以上一致性的同源蛋白，且仍具有丹参酮ⅡA合酶的活性，优选地，其来源于丹参、南丹参、美丽鼠尾草、三叶鼠尾草、红根草、甘西鼠尾草、毛地黄鼠尾草和佛光草，更优选地氨基酸序列如SEQIDNo.2、SEQIDNo.4、SEQIDNo.6、SEQIDNo.8、SEQIDNo.10、SEQIDNo.12、SEQIDNo.14、SEQIDNo.16所示。
5.含有权利要求1或2所述的基因TⅡAS的重组载体，优选为表达载体，更具体为细菌、真菌或植物表达载体，更进一步为大肠杆菌、酵母表达载体。
【专利技术属性】
技术研发人员：杨蕾，陈晓亚，许晶晶，李辰意，宋娇娇，范航，
申请(专利权)人：上海辰山植物园，
类型：发明
国别省市：上海;31
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