调控棉花株高基因GhCYP701A1的克隆及应用制造技术

本发明专利技术公开了调控棉花株高基因GhCYP701A1的克隆及应用，属于生物技术领域。一个棉花赤霉素合成相关基因，即细胞色素P450家族中的GhCYP701A1基因，其序列见SEQ ID NO.1的序列。通过病毒介导的转基因沉默(virus induced gene silencing，VIGS)技术对该基因沉默后发现，基因沉默植株的株高较对照植株显著下降，并且对其内源赤霉素含量的测定也发现该基因沉默后内源赤霉素含量较对照显著下降。通过以上结果表明，该基因参与了赤霉素的合成并能够调控植株高度。

【技术实现步骤摘要】
调控棉花株高基因GhCYP701A1的克隆及应用本专利技术涉及一种调控棉花株高基因GhCYP701A1的克隆及应用，属于生物基因工程

技术介绍
棉花是一种重要的经济作物，天然棉纤维是世界纺织工业的主要原材料。棉属(Gossypiumspp.)中有四个栽培种，包括异源四倍体的陆地棉(GossypiumhirsutumL.)和海岛棉(G.barbadenseL.)，二倍体的草棉(G.herbaceumL.)和亚洲棉(G.arboreumL.)可以生产纺织用天然纤维。其中，陆地棉因产量高、适应性广等特点主导了世界棉花生产。株高是高等作物的重要农艺性状之一，植株过高容易引起倒伏而减产，而矮生植株抗倒伏能力强，高产；同时合理株型又是高产品种的生育基础和形态特征，其中矮生性状是理想株型性状的一个重要方面，因而矮化育种对培育理想株型具有十分重要意义。棉花作为大棵作物，植株较高，受大风、雨涝的影响极易倒伏，导致减产并影响纤维的品质。通过矮化育种来控制株高，可以有效解决倒伏问题，从而实现棉花品种的稳产、高产。此外，随着劳动力成本的逐年提高，植棉成本增加，棉农收益下降，而实施机采棉技术是降低植棉成本和实现棉农增收的有效手段。但是，机采棉对棉花的株型有着一定的要求：第一果枝离地面20～25cm，主茎节间长度6～7cm，株高在65～70cm。虽然化学调控可以达到这一目的，但是大量缩节胺的使用又会给棉农增加较大的经济负担。目前，棉花株高的研究在质量性状和数量性状研究中都有所涉及。在质量性状方面主要是棉花矮杆突变体的获得，例如矮早1号(何鉴星等，1996)，矮化突变体AS98(Zhangetal.2011)，陆地棉超矮秆突变体(陈旭升等，2007)。但是控制这些突变体材料基因的克隆还未见报道。到目前为止，只有Yang等(Yangetal.2014)通过标签在基因组中步移发现转基因造成PAG1基因(该基因参与油菜素内酯合成途径)的插入失活后，转基因后代植株表现为矮化表型。细胞色素P450(CYP450)是一种半硫代酶，参与了从细菌到人类的多种生物合成和异种生物途径。它们催化的反应非常多样，但通常是基于分子氧的活化和异质裂解，将其中一个原子插入底物，并还原另一个原子形成水。CYP450是植物中最大的基因家族之一，拟南芥基因组中有244个CYP450基因(和28个假基因)，参与木质素、木栓质、角质等大分子物质或激素和信号分子的生物合成或分解代谢。在拟南芥CYP450基因家族中CYP88和CYP701参与了赤霉素合成代谢，这两类基因的突变能够导致拟南芥植株矮化表型的出现(Baketal.2011)。参考文献：Bak,S.,F.Beisson,G.Bishop,B.Hamberger,R.Hofer,S.PaquetteandD.Werck-Reichhart(2011)."Cytochromesp450."ArabidopsisBook9:e0144.Yang,Z.,C.Zhang,X.Yang,K.Liu,Z.Wu,X.Zhang,W.Zheng,Q.Xun,C.Liu,L.Lu,Z.Yang,Y.Qian,Z.Xu,C.Li,J.LiandF.Li(2014)."PAG1,acottonbrassinosteroidcatabolismgene,modulatesfiberelongation."NewPhytol203(2):437-448.Zhang,C.,J.L.Sun,Y.H.Jia,J.Wang,Z.J.XuandX.M.Du(2011)."Morphologicalcharacters,inheritanceandresponsetoexogenoushormonesofacottonsuper-dwarfmutantofGossypiumhirsutum."PlantBreeding130(1):67-72.陈旭升,狄佳春,许乃银,肖松华，刘剑光(2007)."陆地棉超矮杆突变性状质量遗传规律分析."遗传29(4):471-474.何鉴星,孙传渭,姜茹琴,王志龙,张欣雪,李爱国,李增书，赵国忠(1996)."棉花矮化突变体的遗传分析."遗传学报23(5):397-402.
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的是提供一种调控棉花赤霉素合成的基因序列及其应用。技术方案本专利技术所提供的一种调控棉花赤霉素合成的基因，该基因命名为GhCYP701A1，它的核苷酸序列为SEQIDNO.1。所述调控棉花赤霉素合成基因GhCYP701A1编码的蛋白质，其特征在于，它的氨基酸序列为SEQIDNO.2。本专利技术提供了含有所述调控棉花赤霉素合成基因GhCYP701A1序列的沉默载体是pTRV-GhCYP710A1。所述调控棉花赤霉素合成基因GhCYP701A1可以在植物株高调控中的应用，特别是在棉花株高调控中的应用。所述调控棉花赤霉素合成基因GhCYP701A1编码的蛋白质可以在植物株高调控中的应用，特别是在棉花株高调控中的应用。有益效果本专利技术利用现有的植物基因工程及RT-PCR技术，分离与鉴定棉花株高相关基因序列信息，克隆到的陆地棉基因在与拟南芥CYP450基因家族成员—AtCYP701A3在进化树构建中处于同一分支，同时由于棉花中还未见报道CYP701这类的细胞色素P450基因，因此将该基因命名为GhCYP701A1。基因表达分析(qRT-PCR)结果表明，随着植株对外源赤霉素的吸收及对内源赤霉素需求的降低，该基因在喷施外源赤霉素后6h的表达量显著降低，对照(0h)的表达量为6h的4.75倍；而随着外源赤霉素含量的降低，内源赤霉素含量需求的增加，该基因的表达显著升高，其中10h、12h和24h的表达量分别为对照(0h)的2.26倍，2.40倍和1.96倍；但随着内源赤霉素合成逐步稳定后，该基因的表达将会趋于平稳(图2A)。同时，该基因在赤霉素突变体中的表达量显著高于对照(陆地棉遗传标准系TM-1)(图2B)。本专利技术通过病毒介导的转基因沉默技术(virusinducedgenesilencing，VIGS)敲除陆地棉细胞色素P450基因GhCYP701A1，经过表型鉴定证明沉默该基因植株的株高显著降低。通过对株高的测定表明，GhCYP701A1基因沉默后，植株的平均株高极显著下降，由对照植株的29.04±2.04厘米下降到沉默植株的22.16±2.43厘米，下降了23.7％(图5A)；对内源GA3的测定发现，GA3的含量也极显著的降低，由对照植株的0.06±0.01ng/ml下降到默植株的0.03±0.01ng/ml，下降了50％(图5B)。附图说明图1GhCYP701A1基因全长cDNA序列的扩增结果。图2实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)分析GhCYP701A1基因表达A:GhCYP701A1基因在500μM赤霉素溶液喷施陆地棉遗传标准系TM-1幼苗叶片在不同时间的表达情况；B:Gh本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种调控棉花赤霉素合成的基因,该基因命名为基因GhCYP701A1，它的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。/n

【技术特征摘要】
1.一种调控棉花赤霉素合成的基因,该基因命名为基因GhCYP701A1，它的核苷酸序列为SEQIDNO.1。


2.权利要求1所述调控棉花赤霉素合成基因GhCYP701A1编码的蛋白质，其特征在于，它的氨基酸序列为SEQIDNO.2。


3.含有权利要求1所述调控棉花赤霉素合成基因GhCYP701A1序列的沉默载体。


4.根据权利要求3所述沉默载体，其特征在于，含有调控棉花赤霉素合成基因GhCYP701A1的沉默载体是pTRV-GhCYP701A1。...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵亮，陈旭升，狄佳春，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32