一种isPLA-Seq的高通量检测蛋白质相互作用的方法和试剂盒及其应用技术

本发明专利技术提供了体外筛选或检测蛋白间相互作用的方法和检测试剂盒及其应用。所述方法包括：1)构建含有第一标签的cDNA文库的第一重组表达载体；2)构建可表达含有第二标签的待研究蛋白的第二重组表达载体；3)将第一重组表达载体和第二重组表达载体共转染细胞，培养一段时间后将细胞进行固定；4)将步骤3)制备的固定后的细胞进行原位邻近连接实验(in situ proximity ligationassay,isPLA),然后分选isPLA阳性细胞；5)将步骤4)获得的isPLA阳性细胞裂解后作为模板，根据第一重组表达载体的外源基因插入位点的上下游序列设计引物进行PCR扩增，然后将PCR产物进行测序，依据序列得出相互作用蛋白的氨基酸序列。互作用蛋白的氨基酸序列。互作用蛋白的氨基酸序列。

【技术实现步骤摘要】
一种isPLA
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Seq的高通量检测蛋白质相互作用的方法和试剂盒及其应用


[0001]本专利技术涉及蛋白质相互作用的检测方法，具体涉及一种利用isPLA
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Seq技术的高通量筛选和检测蛋白质相互作用的方法和试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]细胞的生理功能大多是由蛋白
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蛋白相互作用(protein
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protein interactions,PPIs)介导的，因此对蛋白
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蛋白互作的分子机制研究一直是生命科学和基础医学研究领域的重要内容。
[0003]目前，已经开发了几种筛选PPIs的实验方法，包括酵母双杂交、免疫共沉淀(co
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immunoprecipitation,co
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IP)和蛋白质谱联用技术等，这些实验技术有各自的优缺点。
[0004]酵母双杂交是一种比较传统的成熟技术，具有培养成本较低，对培养条件要求不高的优点，但其也存在不足之处，主要表现为：在酵母细胞中筛选诱饵蛋白的互作蛋白，可能和哺乳动物等来源的蛋白在生理状态下的构象差别较大，从而会遗失部分真实的相互作用，同时还会导致较高的假阳性。
[0005]至于免疫共沉淀和质谱联用技术，其优点在于能够真实反映细胞生理条件下的蛋白互作，不足之处在于难以反映细胞内特定的蛋白质瞬时构象，会丢掉一些互作蛋白，其次一些弱的瞬时互作也比较难以捕捉到，导致产生假阴性结果。此外，该技术对一些膜蛋白等可溶性差的蛋白并不适用，而且后期质谱鉴定对技术的要求比较高，依赖于昂贵的质谱分析仪和检测灵敏度，也容易导致假阳性。
[0006]由于细胞内蛋白质构象处于动态变化中，这些现有技术对于一些瞬时蛋白
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蛋白互作较难捕捉到，更不能高通量地检测蛋白的相互作用。

技术实现思路

[0007]为了克服现有技术的不足，本专利技术的主要目的在于提供一种体外检测蛋白间相互作用的方法，该方法能够在单个细胞中原位筛选相互作用的蛋白，可检测瞬时相互作用，灵敏度高，假阳性率低；而且，所述方法可高通量地筛选相互作用的蛋白，成本低，效率高。
[0008]本专利技术的另一个目的在于提供一种检测试剂盒，用于体外检测蛋白间的相互作用。
[0009]本专利技术的又一目的在于提供上述体外检测蛋白间相互作用的方法和检测试剂盒的应用，所述应用为高通量筛选与待研究蛋白(或称诱饵蛋白)相互作用的蛋白分子。
[0010]为了实现上述专利技术目的，本专利技术的一方面，提供了一种体外检测蛋白间相互作用的方法，包括：
[0011]1)构建含有第一标签的cDNA文库的第一重组表达载体；
[0012]2)构建可表达含有第二标签的待研究蛋白(或称诱饵蛋白)的第二重组表达载体，所述第二标签与第一标签不同，所述第二重组表达载体与第一重组表达载体的出发载体相
同或不同；
[0013]3)将第一重组表达载体和第二重组表达载体共转染细胞，培养一段时间后将细胞进行固定；
[0014]4)将步骤3)制备的固定后的细胞进行原位邻近连接实验(in situ proximity ligation assay,isPLA)，然后分选isPLA阳性细胞；
[0015]5)将步骤4)获得的isPLA阳性细胞裂解作为模板，根据第一重组表达载体的外源基因插入位点的上下游序列设计引物进行polymerase chain reaction(PCR)扩增，然后将PCR产物进行测序，根据测序结果鉴定得到与待研究蛋白(或称诱饵蛋白)可能发生相互作用的蛋白。
[0016]根据本专利技术，所述方法包括非疾病诊断或治疗目的的检测。
[0017]根据本专利技术，步骤1)中的cDNA文库可衍生自各种生物的器官、组织、细胞系或特定类型细胞的mRNA，可以根据待研究蛋白(或称诱饵蛋白)的种类、研究目的(例如了解在某个细胞分化阶段、组织或器官形成阶段、赘生物中的细胞等)来选择，包括但不限于各种类型干细胞或祖细胞，各种已分化的组织细胞(例如白细胞、骨细胞、纤维细胞、血管上皮细胞等)，各种肿瘤细胞(例如肺癌细胞、结肠癌细胞、肝癌细胞等)，生殖细胞等。在本专利技术的一个实施方式中，所述cDNA文库衍生自H1胚胎干细胞。
[0018]根据本专利技术，步骤1)中的所述第一重组表达载体的出发载体可以是本领域常用的原核或真核表达载体，包括但不限于：pcDNA3.1,pCMV,pEGFP等，所述第一重组表达载体的出发载体也可以携带有特异启动子。所述第一重组表达载体的出发载体可以根据后续使用的被转染细胞进行选择，优选是本领域常用的真核表达载体，在本专利技术的一个实施方式中，第一重组表达载体的出发载体是pcDNA3.1。
[0019]根据本专利技术，步骤1)中的所述第一标签可以是本领域常用的标签，包括但不限于：Flag，Myc，HA，S tag以及GFP等荧光蛋白标签。在本专利技术的一个实施方式中，第一标签是Flag、Myc或HA。
[0020]根据本专利技术，在本专利技术的一种实施方式中，步骤1)中，提取细胞的mRNA合成带第一标签的cDNA文库，再克隆到表达载体pcDNA3.1中，获得带第一标签的cDNA文库的重组表达载体pcDNA3.1
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M1
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X(M1代表第一标签，例如Flag，X代表来源于细胞的mRNA的cDNA)。
[0021]根据本专利技术，步骤2)的待研究蛋白(或称诱饵蛋白)可以是来自哺乳动物细胞的任何蛋白，可根据研究目的进行选取，包括但不限于自噬受体蛋白SQSTM1/p62，NDP52、TAX1BP1、Optineurin、p40
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phox、Cdc24、MEK5、p67
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phox、Beml、Par6、MEKK2、MEKK3、TFG、aPKC等。
[0022]细胞自噬(Autophagy)是细胞体内一种高度受调控的，利用溶酶体来清除蛋白聚集体、受损细胞器、入侵病原体等成分以应对内外界细胞压力和维持自身动态平衡的重要分解代谢过程。自噬受体蛋白(autophagy receptor)是一类在选择性细胞自噬过程中发挥着举足轻重作用的衔接蛋白，它可以作为一个桥联蛋白把目标底物与自噬体联系起来，从而介导目标底物的选择性自噬过程。众多人类疾病，如神经退行性疾病等，均与自噬受体蛋白的功能异常或缺失相关。在本专利技术的示例性方法中选取了自噬受体蛋白SQSTM1/p62，研究与该蛋白可能发生相互作用的蛋白。
[0023]根据本专利技术，步骤2)中所述第二重组表达载体的出发载体可以是本领域常用的真
核表达载体，包括但不限于：pcDNA3.1，pCMV,pEGFP等。所述第二重组表达载体的出发载体可以根据后续使用的被转染细胞进行选择。
[0024]根据本专利技术，所述第一重组表达载体和第二重组表达载体的出发载体优选不同载体，以便后续PCR扩增得到特异的cDNA片段。
[0025]在本专利技术的一个实施方式中，第本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种体外检测蛋白间相互作用的方法，其特征在于，包括：1)构建含有第一标签的cDNA文库的第一重组表达载体；2)构建可表达含有第二标签的待研究蛋白的第二重组表达载体，所述第二标签与第一标签不同，所述第二重组表达载体的出发载体与第一重组表达载体的出发载体相同或不同；3)将第一重组表达载体和第二重组表达载体共转染细胞，培养一段时间后将细胞进行固定；4)将步骤3)制备的固定后的细胞进行原位邻近连接实验(in situproximity ligation assay,isPLA),然后分选isPLA阳性细胞；5)将步骤4)获得的isPLA阳性细胞裂解后作为PCR的模板，根据第一重组表达载体的外源基因插入位点的上下游序列设计引物进行PCR扩增，然后将PCR产物进行测序，以鉴定与待研究蛋白可能发生相互作用的蛋白；优选的，所述方法进一步包括步骤6)，利用重组克隆技术将步骤5)获得的PCR产物构建含有第一标签的阳性cDNA亚文库，再重复步骤1)至5)，通过多轮筛选来逐步富集isPLA阳性细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述第一重组表达载体的出发载体是真核表达载体，优选pcDNA3.1，所述第一标签优选Flag或HA。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述第二重组表达载体的出发载体是真核表达载体，优选pcDNA3.1或pCMV
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HA，所述第二标签优选HA或Flag。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的方法，其特征在于，步骤5)中，上下游引物分别为：5
’‑
GCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAAC
‑3’
和5
’‑
TGACACCTACTCAGACAATG...

【专利技术属性】
技术研发人员：马振毅，刘喆，周瑞敏，殷曰苑，王国斌，
申请(专利权)人：天津医科大学，
类型：发明
国别省市：