用于基因突变检测的发夹式扩增阻断法的引物和探针及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种用于基因突变检测的发夹式扩增阻断法的引物和探针及其应用。本发明专利技术提供的引物和探针包括通用引物A、通用引物B和野生型阻断探针P；通用引物A和B用于扩增含有靶突变位点的靶序列，与野生型靶序列W和扩增的突变靶序列M完全互补；野生型阻断探针P与通用引物A的延伸的野生型靶序列W完全互补，并且部分互补于通用引物A的延伸的突变靶序列M；野生型阻断探针P的互补位点的5'端与通用引物B的互补位点的3'端部分重叠；优选探针P以其3'端通过共价基团与引物A的5'端结合形成野生型阻断探针P-通用引物A复合物的形式存在。本发明专利技术的技术可用于基因突变的快速检测，灵敏度小于1％。于1％。于1％。

Primer and probe of hairpin amplification blocking method for gene mutation detection and its application

【技术实现步骤摘要】
用于基因突变检测的发夹式扩增阻断法的引物和探针及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体是关于一种用于基因突变检测的发夹式扩增阻断法的引物和探针，所述引物和探针的设计方法，以及所述引物和探针的相关应用。

技术介绍

[0002]美国人Mullis于1985年发现了聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)，并且早已广泛用于科学研究和临床检测。引物、模板、聚合酶是PCR反应系统的必要组分，目前市场上已有大量成熟的PCR反应试剂提供，用户只需加入引物和模板即进行PCR反应。因此，引物设计是决定PCR反应应用成功与否的关键因素。
[0003]随着生命科学的飞速发展，基因突变检测的重要性越来越受关注。目前已知部分主流肿瘤靶向治疗药物的疗效，与肿瘤基因突变密切相关。K-Ras基因是公认的癌基因，参与EGFR信号传导过程。2008年6月在美国临床肿瘤学会(ASCO)年会上发布了最新临床研究结果，即K-Ras突变型患者并不能从抗EGFR治疗中获益，反而徒增不良反应危险和治疗费用；而K-Ras野生型患者就很有可能从这类药物治疗中获益。同年10月，K-Ras基因突变检测被写入最新版(2008年第3版)《美国国立癌症综合网络(NCCN)结直肠癌临床实践指南》。该指南明确指出两点，一是所有转移性结直肠癌患者都应检测K-Ras基因状态，二是只有K-Ras野生型患者才建议接受EGFR抑制剂(如西妥昔单抗和帕尼单抗)治疗。2009年《NCCN非小细胞肺癌临床实践指南》明确指出：如果K-Ras基因发生了突变，则不建议病人使用特罗凯(Tarceva/厄洛替尼/Erlotinib)进行分子靶向治疗。因此，肿瘤基因突变检测越来越受重视。
[0004]目前为了特异性抑制野生型序列的扩增并选择性扩增突变型序列，常见的基因突变检测方法有测序法、等位特异性扩增法及非全匹配的等位特异性扩增法、蝎形引物法、环形引物法、肽核酸阻断法、MGB探针阻断法等。传统的DNA测序法虽然被公认是基因突变检测的“金标”方法，但由于其检测灵敏度仅约10％，不能满足临床检测需要，不能广泛应用。采用突变特异性引物，如等位特异性扩增法、蝎形引物法、环形引物法，用于检测多重突变，如KRAS密码子12和密码子13的基因突变的12种，通常每个反应管只能检测一种突变，因此试剂的成本较高，相关产品用于临床检测时，医院也是按照突变反应管的数量来收费，因此检测KRAS的8种突变的收费价格就普通基因检测的8倍。目前厦门某公司提供的KRAS基因突变检测产品可检7种KRAS基因突变，但每个样品均需做8个反应管；此产品在郑州2011的中标价格高达1050元每人份。北京某公司提供的KRAS基因突变检测产品可检8种KRAS基因突变，但每个样品均需做8个反应管；此在中山肿瘤医院2011的中标价格高达1180元每人份。同时广东省物价局规定的收费标准为：k-ras基因突变荧光定量聚合酶链式反应(PCR)法1323元/次(约为普通荧光定量聚合酶链式反应(PCR)法的8倍)。中山肿瘤医院公布的“双脱氧链终止法-测序法”收费标准为230元/次。现有MGB探针阻断法用于基因突变检测，通常也需结合突变特异性引物，才能有较好的特异性。肽核酸阻断法用于KRAS基因突变检测等，已有现
成检测试剂盒，但目前肽核酸仍有专利保护，全世界仅数家公司提供肽核酸的合成服务，中国国内还没有提供肽核酸合成服务的公司，因此，肽核酸的合成成本较高，肽核酸阻断法的运用受到较大限制。

技术实现思路

[0005]本专利技术的一个目的在于以高特异性检测非常低含量的体细胞突变，提供一种快速、高精度和低成本的基因突变检测方法。
[0006]一方面，本专利技术提供了一种引物和探针组合物，其包括：通用引物A，通用引物B和野生型阻断探针P；其中：
[0007]通用引物A和通用引物B用于扩增含有靶突变位点的靶序列，通用引物A和通用引物B与野生型靶序列W和扩增的突变靶序列M完全互补；
[0008]野生型阻断探针P与通用引物A的延伸的野生型靶序列W完全互补，并且部分互补于通用引物A的延伸的突变靶序列M；
[0009]野生型阻断探针P的互补位点的5'端与通用引物B的互补位点的3'端部分重叠。
[0010]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的引物和探针组合物中，野生型阻断探针P是以其3'端通过共价基团与引物A的5'端结合形成野生型阻断探针P-通用引物A复合物的形式存在。
[0011]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的引物和探针组合物中，野生型阻断探针P的3'端通过共价基团与引物A的5'端结合，其中的共价基团包括但不限于磷酸基，C3 Spacer，Spacer 9，3'C6 Spacer，dSpacer，PC Spacer或Spacer 18。
[0012]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的引物和探针组合物中，野生型阻断探针P的互补位点的5'端与通用引物B的互补位点的3'端部分重叠的长度为1-15个碱基。
[0013]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的引物和探针组合物中，通用引物B的3'端与所述野生型阻断探针P重叠，靠近所述突变位点，间隔为0-10个碱基。
[0014]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的引物和探针组合物中，与野生型阻断探针共价结合的通用引物A的3'端，不靠近突变位点，间隔不小于15个碱基。
[0015]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的引物和探针组合物中，通用引物A、通用引物B和野生型阻断探针P各自的长度分别为15-40个碱基，熔解温度为50-65℃。通用引物A、通用引物B和野生型阻断探针P之间的熔解温度差不超过10℃。
[0016]本专利技术的通用引物A、通用引物B和野生型阻断探针P设计位点可参见图1所示。野生型阻断探针P特异性识别通用引物A的野生型延伸产物可参见图2所示。
[0017]本专利技术的引物和探针组合物，可以在扩增过程中选择性扩增突变靶序列。扩增后的产物可用于DNA测序，能够检测含量低至1％-0.1％的基因突变。
[0018]另一方面，本专利技术还提供了一种用于基因突变检测的试剂盒，其包括前述的本专利技术的引物和探针组合物。
[0019]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的试剂盒还选择性包括以下中的一种或多种：DNA聚合酶，脱氧核糖核苷酸，测序引物。优选地，其中所述测序引物为通用引物A。
[0020]另一方面，本专利技术还提供了一种用于基因突变检测的发夹式扩增阻断方法，其中，核酸扩增反应系统主要包括野生型阻断探针P-通用引物A复合物，通用引物B，热稳定的DNA
聚合酶，脱氧核糖核苷酸和DNA模板。
[0021]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的用于基因突变检测的发夹式扩增阻断方法，核酸扩增反应的退火温度为55-65℃，退火时间为5-60秒。
[0022]本专利技术的用于基因突变检测的发夹式扩增阻断方法，其中核酸扩增反应可进一步结合荧光PCR检测技术，可以通过分析荧光PCR检测结果快速确定样品是否突变。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种引物和探针组合物，其包括：通用引物A，通用引物B和野生型阻断探针P；其中：通用引物A和通用引物B用于扩增含有靶突变位点的靶序列，通用引物A和通用引物B与野生型靶序列W和扩增的突变靶序列M完全互补；野生型阻断探针P与通用引物A的延伸的野生型靶序列W完全互补，并且部分互补于通用引物A的延伸的突变靶序列M；野生型阻断探针P的互补位点的5'端与通用引物B的互补位点的3'端部分重叠。2.根据权利要求1所述的引物和探针组合物，其中，野生型阻断探针P是以其3'端通过共价基团与引物A的5'端结合形成野生型阻断探针P-通用引物A复合物的形式存在。3.根据权利要求2所述的引物和探针组合物，其中，野生型阻断探针P的3'端与引物A的5'端结合的共价基团包括：磷酸基，C3 Spacer，Spacer 9，3'C6 Spacer，dSpacer，PC Spacer或Spacer 18。4.根据权利要求1～3任一项所述的引物和探针组合物，其中，野生型阻断探针P的互补位点的5'端与通用引物B的互补位点的3'端部分重叠的长度为1-15个碱基。5.根据权利要求1～3任一项所述的引物和探针组合物，其中，通用引物B的3'端与所述野生型阻断探针P重叠，靠近所述突变位点，间隔为0-10个碱基；通用引物A的3'端，不靠近突变位点，间隔不小于15个碱基...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨梦甦，徐涛，邹恒，
申请(专利权)人：香港城市大学深圳研究院，
类型：发明
国别省市：