一种尤文肉瘤相关融合基因检测探针组合物、试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种尤文肉瘤相关融合基因检测探针组合物、试剂盒及其应用，所述探针组合物的靶基因包括NUTM2B全外显子、FUS全外显子、YWHAE全外显子、CIC全外显子、EWSR1全外显子、EWSR17～8号内含子、EWSR1 8～9号内含子及BCOR全外显子。本发明专利技术针对尤文肉瘤常见的基因融合突变形式，设计全面覆盖融合基因突变位点的探针组合物，显著提高了不同融合现象的检出率，降低了漏检率。降低了漏检率。降低了漏检率。

【技术实现步骤摘要】
一种尤文肉瘤相关融合基因检测探针组合物、试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于基因检测
，涉及一种尤文肉瘤相关融合基因检测探针组合物、试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]尤文肉瘤(Ewing sarcoma，ES)是一种少见的小圆细胞恶性肿瘤，属于尤文氏肉瘤家族肿瘤(Ewing sarcoma family of tumors，ESFT)，好发于5～15岁，男孩较女孩多见。该病虽然罕见，但是发生于骨的ES是影响儿童和青少年健康的第二常见原发性恶性骨肿瘤，这类肿瘤恶性程度高、易复发、预后差。
[0003]尤文肉瘤以22q12染色体上EWS基因(EWSR1)与ETS基因家族的几种基因(FLI1、ERG、ETV1、ETV4、FEV)融合为特征。85％的尤文肉瘤患者中，出现了EWS与11号染色体上FLI1基因的融合，以及相应的t(11；22)(q24；q12)染色体易位导致的EWS
‑
FLI1融合基因转录。在5％～10％的病例中，EWS与ETS基因家族的其他基因相融合。在极少数病例中，FUS替代EWS，导致没有EWS的重新排列，发生由t(16；21)(p11；q24)易位导致的FUS
‑
ERG融合基因转录或t(2；16)(q35；p11)易位导致的FUS
‑
FEV融合基因转录。
[0004]随着分子生物学的发展，尤文样肉瘤亚型也需要进一步明确，例如BCOR
‑
CCNB3、CIC
‑
DUX4是已发现的尤文样肉瘤亚型，其治疗方案和原则与尤文肉瘤类似，但是预后可能有显著差异。
[0005]目前在临床上，主要采用荧光原位杂交技术(FISH)对EWS
‑
FLI1融合进行检测，为尤文肉瘤的临床诊断提供辅助判断依据。但是FISH检测探针成本高且操作繁琐、结果判读耗时且存在主观误差等，同时EWS
‑
FLI1融合只出现在85％左右的尤文肉瘤患者中，可能导致漏检。
[0006]CN108559780A公开了用于肿瘤融合基因EWS
‑
FLI1检测的引物对、探针、试剂盒及其两步检测法，属于基因工程
，能够解决现有的对于融合基因EWS
‑
FLI1的检测操作繁琐、结果判读耗时且存在主观误差等技术问题。该用于肿瘤融合基因EWS
‑
FLI1检测的引物对包括：用于融合基因EWS
‑
FLI1 I型融合的如SEQ No.1序列所示的正向引物EWS_F、如SEQ No.2序列所示的反向引物FLI1_Exon 7&8R；和用于融合基因EWS
‑
FLI1 II型融合的如SEQ No.1序列所示的正向引物EWS_F、如SEQ No.4序列所示的反向引物FLI1_Exon 6&7R。本专利技术能够应用于EWS
‑
FLI1融合基因的定量检测中，进而有效用于尤文肉瘤家族肿瘤的检测中。但是，该引物对、探针、试剂盒仅能检测融合基因EWS
‑
FLI1的两个位点，不能完全覆盖造成尤文肉瘤的基因突变区。

技术实现思路

[0007]针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供了一种尤文肉瘤基因检测探针组合物、试剂盒及其应用，通过一次性检测数十种融合基因，有利于尤文肉瘤、非ETS融合小圆细
胞肿瘤、尤文样肿瘤(CIC重排肉瘤、BCOR重排肉瘤)的一次性鉴别诊断。
[0008]为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0009]第一方面，本专利技术提供了一种尤文肉瘤相关融合基因检测探针组合物，所述探针组合物的靶基因包括NUTM2B全外显子、FUS全外显子、YWHAE全外显子、CIC全外显子、EWSR1全外显子、EWSR1 7～8号内含子、EWSR1 8～9号内含子或BCOR全外显子中的任意一种或至少两种的组合。
[0010]本专利技术中，针对尤文肉瘤常见的基因融合突变形式，参考图1设计探针，覆盖包含BCOR、CIC、EWSR1、FUS、NUTM2B、YWHAE 6个基因全外显子及EWSR1 2个内含子intron7
‑
8、intron8
‑
9位点，在尤文肉瘤样本DNA和RNA两个层面进行样本检测，有利于实现基于杂交捕获的高通量测序技术的精准分子分型及治疗、预后相关提示。
[0011]优选地，所述探针组合物在染色体上的杂交位点如下表所示；
[0012][0013][0014][0015][0016][0017]。
[0018]常规融合基因的捕获探针主要选择融合基因和融合伴侣基因在融合断点两端的位点设计探针，存在阳性检出率低、只能检出探针特异性断点位置的融合现象的问题；本专利技术中，针对融合基因突变，采用单端基因全外显子区域全覆盖的原则设计探针，伴侣基因根据测序结果进行确认，该探针设计方法显著提高了因融合断点位置不同导致的不同融合现象的检出率，降低了漏检率。
[0019]优选地，所述探针组合物包括SEQ ID NO:1～204所示的核酸序列。
[0020]第二方面，本专利技术提供了一种尤文肉瘤相关融合基因检测试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的探针组合物。
[0021]优选地，所述试剂盒还包括反转录试剂、测序文库构建试剂、PCR试剂或探针杂交试剂中的任意一种或至少两种的组合。
[0022]优选地，所述反转录试剂包括一链cDNA合成缓冲液、一链cDNA合成酶、二链cDNA合成缓冲液或二链cDNA合成酶中的任意一种或至少两种的组合。
[0023]优选地，所述测序文库构建试剂包括DNA片段化缓冲液、DNA片段化酶、末端加A尾缓冲液、末端加A尾酶、连接缓冲液、连接酶或接头中的任意一种或至少两种的组合。
[0024]优选地，所述PCR试剂包括PCR缓冲液和/或PCR引物。
[0025]优选地，所述探针杂交试剂包括杂交缓冲液和/或RNA酶抑制剂。
[0026]优选地，所述试剂盒还包括核酸纯化试剂。
[0027]优选地，所述核酸纯化试剂包括磁珠和/或清洗液。
[0028]第三方面，本专利技术提供了一种以非疾病诊断为目的的尤文肉瘤相关融合基因检测方法，所述检测方法以从样本(例如石蜡样本、病理鉴定确认的新鲜组织样本)中提取的DNA和RNA为检测对象，通过探针组合物靶向捕获富集目标区域进行高通量测序，后续进行融合变异的分析，实现了在一个反应管中同时检测DNA和RNA两个层面的融合突变现象的效果，流程图如图2所示，包括以下步骤：
[0029]从样本中提取DNA和RNA，对RNA进行片段化，同步进行一链cDNA合成和二链cDNA合成，得到cDNA/DNA复合物；
[0030]使用片段化酶打断cDNA/DNA复合物，并进行末端修复和加A尾、接头连接、PCR富集和纯化，得到基于总核酸构建的全基因组测序(WGS)文库(总量不少于200ng)；
[003本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种尤文肉瘤相关融合基因检测探针组合物，其特征在于，所述探针组合物的靶基因包括NUTM2B全外显子、FUS全外显子、YWHAE全外显子、CIC全外显子、EWSR1全外显子、EWSR1 7～8号内含子、EWSR1 8～9号内含子或BCOR全外显子中的任意一种或至少两种的组合。2.根据权利要求1所述的探针组合物，其特征在于，所述探针组合物在染色体上的杂交位点如下表所示；
。3.根据权利要求1或2所述的探针组合物，其特征在于，所述探针组合物包括SEQ ID NO:1～204所示的核酸序列；SEQ ID NO:1：GGGAAGGAGCATGGGTTGATTGGCACAAAAGTAGGTCTGCTGATAAAGAATGGAAGTAAAGGGGCCATCAGGTAGAAGCTTTTGCTGTGAGTCAGAAGGACAATTTAAAAGTTGCCTAAA；SEQ ID NO:2：
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【专利技术属性】
技术研发人员：林灵，侯群星，魏利然，刘静仪，张朔，王永攀，武晓会，文明，楼敬伟，
申请(专利权)人：上海宝藤医学检验所有限公司上海张江医学创新研究院，
类型：发明
国别省市：