本发明专利技术提供了检测16p11.2微缺失的引物探针组合物、试剂盒及其应用，所述引物探针组合物检测染色体16p11.2上32.5～33.8M缺失突变；所述引物探针组合物包括SEQ ID NO:1～3、SEQ ID NO:4～6、SEQ ID NO:7～9、SEQ ID NO:10～12和SEQ ID NO:13～15。本发明专利技术针对染色体16p11.2上32.5～33.8M区域内近1.25Mb缺失突变，选择5个特定的缺失位点设计特异性引物和Taqman探针，实现了利用基于Taqman的特异、灵敏的多重qPCR直接检测16p11.2微缺失状态的效果。果。果。
【技术实现步骤摘要】
检测16p11.2微缺失的引物探针组合物、试剂盒及其应用
[0001]本专利技术属于核酸检测
，涉及检测16p11.2微缺失的引物探针组合物、试剂盒及其应用。
技术介绍
[0002]16p11.2微缺失综合征是一类先天性基因缺陷病，常用的分子诊断方法包括微阵列比较基因组杂交(Array comparative genomic hybridization，array CGH)、多重连接探针扩增分析(Multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)、荧光原位杂交分析(FISH)和定量聚合酶链连锁反应(qPCR)等。
[0003]目前临床上常用的array CGH，微阵列芯片属于寡核苷酸平台，检测结果准确性弱，还需要进一步检测才能确定DNA缺失的长度，且芯片检测法存在检测时间长的问题，检测周期大于5天，检测成本高。MLPA是一种定量聚合酶反应分析方法，能够检测出DNA重复序列的数目，然而该方法的检测周期也大于 5天，检测不同的缺失区间需要定制探针，检测成本高。FISH技术作为检测 16p11.2微缺失综合征的金标准，可以检测到DNA缺失，但是无法确定缺失片段的大小，检测成本高，不适合作为疾病筛查方法。qPCR是功能强大的基因检测方法，仅需针对特定目标区域设计探针引物即可检测出DNA重复序列的数目，检测周期短，成本低，适合于临床筛查16p11.2微缺失表征的患者。
[0004]CN109182493A公开了人16p11.2微缺失综合征检测的引物和试剂盒及其检测方法，主要采用基于SYBR Green I染料法的qPCR反应体系，与质控对照组ΔCt进行比较，判断是否发生杂合缺失，该方法只能间接推断是否患有16p11.2 微缺失综合征，检测结果存在一定误差。
[0005]CN105624308A公开了一种检测染色体16p11.2微缺失的产品，通过检测染色体16p11.2上29.5～30.1Mb区域内的SNP位点的基因型，判断是否存在染色体微缺失，亦是属于间接检测法，不能直接检测染色体微缺失。
[0006]因此，有必要建立一种直接检测方法，用于16p11.2微缺失综合征的筛查和检测。
技术实现思路
[0007]针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供了检测16p11.2微缺失的引物探针组合物、试剂盒及其应用，所述引物探针组合物为针对染色体16p11.2上特定缺失的1.25Mb区间设计的，基于Taqman探针法的qPCR反应体系实现了对目标区域的直接、准确、快速检测。
[0008]为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0009]第一方面，本专利技术提供了检测16p11.2微缺失的引物探针组合物，所述引物探针组合物检测染色体16p11.2上32.5～33.8M区间的缺失突变；
[0010]所述引物探针组合物包括(a)～(e)：
[0011](a)检测第一缺失区段F1R1的引物探针：
[0012]上游引物SEQ ID NO:1：GGGTCAGAGCATGTGCATAA；
[0013]下游引物SEQ ID NO:2：CACAGAGAATCAGGGAGAAAGG；
[0014]探针SEQ ID NO:3：CTGCATCAGGTTCTGGGCTCCA；
[0015](b)检测第二缺失区段F2R2的引物探针：
[0016]上游引物SEQ ID NO:4：CTAATGTTGACCAGGGAGCTATG；
[0017]下游引物SEQ ID NO:5：AGATGAGGGCCTAGCAGATTA；
[0018]探针SEQ ID NO:6：TCTTGTGGCCAGCTTCAGAGAACC；
[0019](c)检测第三缺失区段F3R3的引物探针：
[0020]上游引物SEQ ID NO:7：TGGGAGGAGAGTGTGGTAAA；
[0021]下游引物SEQ ID NO:8：GTGGATACACGCAGACAAAGA；
[0022]探针SEQ ID NO:9：AGCAGAGGTCTAAACTGGGTGTCTCT；
[0023](d)检测第四缺失区段F4R4的引物探针：
[0024]上游引物SEQ ID NO:10：GTGGAGTCAGGAGCTTTGTT；
[0025]下游引物SEQ ID NO:11：GTCTTAGGCTTTGGCCTCTC；
[0026]探针SEQ ID NO:12：AGTGCTGGGCATAGTGAGAAGTCA；
[0027](e)检测第五缺失区段F5R5的引物探针：
[0028]上游引物SEQ ID NO:13：GGGAGCAAGGCATCTTACA；
[0029]下游引物SEQ ID NO:14：CTTGTGCTGTCTTGCGATAAC；
[0030]探针SEQID NO:15：AGAACAGGAGCAACACAGAGAGCG。
[0031]本专利技术中，针对染色体16p11.2上32.5～33.8M缺失突变，对突变序列进行分析，平衡各序列之间的稳定性、反应条件、扩增效率，选择5个特定的缺失位点设计特异性引物和Taqman探针，五组引物探针与一对内参引物在两个反应体系中进行扩增，其中，针对F1R1、F2R2、F3R3区段和内参基因的引物探针组合物处于第一反应体系中，针对F4R4、F5R5区段和内参基因的引物探针组合物处于第二反应体系中，相同反应体系中的引物探针组合物扩增效率一致，且可以避免引物间的交叉影响，实现了利用基于Taqman的特异、灵敏的多重 qPCR直接检测16p11.2微缺失状态的效果。
[0032]优选地，所述检测染色体16p11.2上32.5～33.8M缺失突变的探针的5
’
端修饰有荧光基团，3
’
端修饰有荧光淬灭基团。
[0033]为确保相同反应体系的扩增产物标记有不同的荧光基团，本专利技术的处于相同反应体系中的不同Taqman探针的5
’
荧光基团不同，例如可以是，在第一反应体系中，检测F1R1、F2R2、F3R3、内参基因的探针的5
’
端分别修饰有FAM、 VIC、TAMRA和ROX，在第二反应体系中，检测F4R4、F5R5、内参基因的探针的5
’
端分别修饰有FAM、VIC和ROX。
[0034]第二方面，本专利技术提供了一种检测16p11.2微缺失的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的引物探针组合物。
[0035]优选地，所述试剂盒还包括检测内参基因的引物探针。
[0036]优选地，所述内参基因包括EFTUD2。
[0037]优选地，所述EFTUD2的引物探针包括：
[0038]上游引物SEQ ID NO:16：GGTCTTGCCAGACACCAAAG；
[0039]下游引物SEQ ID NO:17：T本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.检测16p11.2微缺失的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物检测染色体16p11.2上32.5～33.8M区域的缺失突变；所述引物探针组合物包括(a)～(e)：(a)检测第一缺失区段F1R1的引物探针：上游引物SEQ ID NO:1：GGGTCAGAGCATGTGCATAA；下游引物SEQ ID NO:2：CACAGAGAATCAGGGAGAAAGG；探针SEQ ID NO:3：CTGCATCAGGTTCTGGGCTCCA；(b)检测第二缺失区段F2R2的引物探针：上游引物SEQ ID NO:4：CTAATGTTGACCAGGGAGCTATG；下游引物SEQ ID NO:5：AGATGAGGGCCTAGCAGATTA；探针SEQ ID NO:6：TCTTGTGGCCAGCTTCAGAGAACC；(c)检测第三缺失区段F3R3的引物探针：上游引物SEQ ID NO:7：TGGGAGGAGAGTGTGGTAAA；下游引物SEQ ID NO:8：GTGGATACACGCAGACAAAGA；探针SEQ ID NO:9：AGCAGAGGTCTAAACTGGGTGTCTCT；(d)检测第四缺失区段F4R4的引物探针：上游引物SEQ ID NO:10：GTGGAGTCAGGAGCTTTGTT；下游引物SEQ ID NO:11：GTCTTAGGCTTTGGCCTCTC；探针SEQ ID NO:12：AGTGCTGGGCATAGTGAGAAGTCA；(e)检测第五缺失区段F5R5的引物探针：上游引物SEQ ID NO:13：GGGAGCAAGGCATCTTACA；下游引物SEQ ID NO:14：CTTGTGCTGTCTTGCGATAAC；探针SEQ ID NO:15：AGAACAGGAGCAACACAGAGAGCG。2.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述检测染色体16p11.2上32.5～33.8M区域的缺失突变的探针的5
’
端修饰有荧光基团，3
’
端修饰有荧光淬灭基团。3.一种检测16p11.2微缺失的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物探针组合物；优选地，所述试剂盒还包括检测内参基因的引物探针，优选为检测EFTUD2的引物探针；优选地，所述EFTUD2的引物探针包括：上游引物SEQ ID NO:16：GGTCTTGCCAGACACCAAAG；下游引物SEQ ID NO:17：TGAGAGGACACACGCAAAAC；探针SEQ ID NO:18：GGACATCCTTTGGCTTTTGA；优选地，所述检测EFTUD2的探针的5
’
端修饰有荧光基团，3
’
【专利技术属性】
技术研发人员：魏利然，蒋丽莎，林灵，王永攀，孔芬，丁飞飞，殷月鹏，王新军，楼敬伟，
申请(专利权)人：上海宝藤医学检验所有限公司上海张江医学创新研究院，
类型：发明
国别省市：
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