一种恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019-nCoV的引物探针组合及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019

【技术实现步骤摘要】
一种恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019
‑
nCoV的引物探针组合及其应用


[0001]本专利技术属于核酸检测
，尤其涉及一种恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019
‑
nCoV的引物探针组合及其应用。

技术介绍

[0002]新型冠状病毒2019
‑
nCoV属于冠状病毒科、beta冠状病毒属，有包膜，病毒颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60～140nm，是目前已知的可以感染人的第7种冠状病毒，其余6种冠状病毒分别是HCoV
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229E、HCoV
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OC43、HCoV
‑
NL63、HCoV
‑
HKU1、SARS
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CoV和MERS
‑
CoV。其中前4种在人群中较为常见，致病性较低，一般仅引起类似普通感冒的轻微呼吸道症状；另外2种SARS
‑
CoV和MERS
‑
CoV(中东呼吸综合症冠状病毒)则会引起严重的呼吸道病症。
[0003]新型冠状病毒(2019novel Coronavirus，2019
‑
nCoV)是继SARS
‑
CoV及MERS
‑
CoV后一种新发现的传播力强、可感染人的冠状病毒。该病毒引发干咳、嗓子疼痛、头晕、乏力等症状，与普通感冒发烧不易区别，且现阶段由于新型冠状病毒的潜伏感染病例增多，很难从表型上有效判断潜在感染人群，增加了监控的难度。目前，核酸检测是判定该病毒的金标准，在普遍使用的自动化核酸抽提仪配套荧光定量PCR检测方法下，整个实验流程至少需要2.5～3小时，并且需要使用复杂的仪器和装备精良的实验室。在大规模城市、进出口海关、机场或基层单位进行普筛时，急需更小型的POCT设备、方便快速的检测方法和相应的产品。部分研究人员利用恒温扩增方案进行相关的检测，但存在灵敏度低、易出现假阳性以及引物设计和反应体系复杂等问题。
[0004]因此，如何提供一种灵敏度高、特异性好、使用方便的新型冠状病毒的检测产品及对应的使用方法，已成为亟待解决的问题。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019
‑
nCoV的引物探针组合及其应用，所述引物探针组合具有良好的灵敏度，能在20min内快速、高特异性地检测到低水平的模板，与国内同类恒温扩增检测新冠核酸的产品相比，检测时间更短，灵敏度更高，且不易产生由高温引起的气溶胶污染；另外，恒温检测仪器相对低廉的价格为相关产品在基层技术条件落后地区的应用提供了条件。
[0006]为达此目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]第一方面，本专利技术提供了一种恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019
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nCoV的引物探针组合，所述恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019
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nCoV的引物探针组合包括特异性扩增并检测2019
‑
nCoV的ORF1ab基因和核壳蛋白N基因的特异性引物对和探针；
[0008]所述探针的结构包括从5
’
端到3
’
端顺次连接的5
’
端序列、荧光发生基团、四氢呋喃、间隔序列、荧光淬灭基团、3
’
端序列和C3阻断基团。
[0009]本专利技术中，利用RPA(recombinase polymerase amplification，重组酶聚合酶扩
增)恒温扩增
‑
实时荧光法结合水解探针技术，可以特异性对ORF1ab基因、N基因进行同步检测，从而快速、准确地对病毒进行有效预防和监控，灵敏度高，重复性好，精密度高，对于在基层进行大规模筛查具有极大的时效性和应用前景。
[0010]在所有恒温扩增技术中，RPA的检测时间仅需5～20min。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡聚核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(single strand DNA
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binding protein，SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也具有活性，其最佳反应温度在37～42℃。
[0011]RPA技术的反应原理如图1所示：
[0012]重组酶与引物结合，形成蛋白
‑
DNA复合物，随后在dsDNA中寻找同源序列，引物定位同源序列后，就会发生链交换反应，形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。而被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步被替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快，一般可在10分钟之内获得可检出水平的扩增产物。
[0013]RPA技术模拟了生物体内DNA复制、基于重组酶
‑
聚合酶介导的扩增过程，它可以在极短的时间内使目的基因以指数级增长，若配合荧光标记的探针和荧光信号检测仪便可实现对模板扩增的实时监测。RPA恒温扩增技术可应用于生物防护、水体检验、食品检验、医疗诊断、微流体、兽医等于众多领域。此外，RPA恒温扩增技术对环境和硬件设施的要求相对很低，对于温度的要求也不是很高，它能够在恒定温度、较低温度下进行单分子核酸检测，大大降低了核酸检测的成本。
[0014]本专利技术中，通过将探针设计成具有从5
’
端到3
’
端顺次连接的5
’
端序列、荧光发生基团、四氢呋喃(THF)、间隔序列、荧光淬灭基团、3
’
端序列和C3阻断基团的结构，有利于同源重组反应以及引物与模板之间的替换。与传统探针相比，具有上述结构的探针提供了更多的互补位点，并且释放出可供检测的荧光信号，提高了检测反应的灵敏度；在探针末端设计C3阻断基团(C3 spacer)，可以抑制扩增反应，从而提高检测反应的特异性。
[0015]优选地，所述5
’
端序列的长度为不少于30bp，例如可以是30bp、31bp、32bp、33bp、34bp或35bp等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
[0016]优选地，所述荧光发生基团包括FAM、ROX或CY5中的任意一种。
[0017]优选地，所述间隔序列的长度为2～5bp，例如可以是2bp、3bp、4bp或5bp。
[0018]优选地，所述荧光淬灭基团包括BHQ1或BHQ2中的任意一种。
[0019]优选地，所述3
’
端序列的长度为不少于13bp，例如可以是13bp、14bp、15bp、16bp、17bp、18bp、19bp或20bp等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
[0020]优选地，检测所述ORF1ab基因的探针的荧光发生基团包括FAM，荧光淬灭基团包括BHQ1。
[0021]优选地，检测所述核壳蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019
‑
nCoV的引物探针组合，其特征在于，所述恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019
‑
nCoV的引物探针组合包括特异性扩增并检测2019
‑
nCoV的ORF1ab基因和核壳蛋白N基因的特异性引物对和探针；所述探针的结构包括从5
’
端到3
’
端顺次连接的5
’
端序列、荧光发生基团、四氢呋喃、间隔序列、荧光淬灭基团、3
’
端序列和C3阻断基团。2.根据权利要求1所述的恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019
‑
nCoV的引物探针组合，其特征在于，所述5
’
端序列的长度为不少于30bp；优选地，所述荧光发生基团包括FAM、ROX或CY5中的任意一种；优选地，所述间隔序列的长度为2～5bp；优选地，所述荧光淬灭基团包括BHQ1或BHQ2中的任意一种；优选地，所述3
’
端序列的长度为不少于13bp。3.根据权利要求1或2所述的恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019
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nCoV的引物探针组合，其特征在于，检测所述ORF1ab基因的探针的荧光发生基团包括FAM，荧光淬灭基团包括BHQ1；优选地，检测所述核壳蛋白N基因的探针的荧光发生基团包括ROX，荧光淬灭基团包括BHQ2。4.根据权利要求1～3任一项所述的恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019
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nCoV的引物探针组合，其特征在于，扩增所述ORF1ab基因的特异性引物对包括SEQ ID No.1～2所示的核苷酸序列，检测所述ORF1ab基因的探针包括SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；优选地，扩增所述核壳蛋白N基因的特异性引物对包括SEQ ID No.4～5所示的核苷酸序列，检测所述核壳蛋白N基因的探针包括SEQ ID No.6所示的核苷酸序列。5.根据权利要求1～4任一项所述的恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019
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nCoV的引物探针组合，其特征在于，所述恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019
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nCoV的引物探针组合还包括特异性扩增并检测内标基因GAPDH的特异性引物对和探针；优选地，检测所述内标基因GAPDH的探针的荧光发生基团包括CY5，荧光淬灭基团包括BHQ2；优选地，扩增所述内标基因GAPDH的特异性引物对包括SEQ ID No.7～8所示的核苷酸序列，检测所述内标基因GAPDH的探针包括SEQ ID No.9所示的核苷酸序列。6.一种恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019
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【专利技术属性】
技术研发人员：习杨，刘晏霖，楼敬伟，
申请(专利权)人：上海宝藤医学检验所有限公司上海张江医学创新研究院，
类型：发明
国别省市：