一种基于CRISPR技术检测甘薯G病毒的方法技术

本发明专利技术提供了一种基于CRISPR技术检测甘薯G病毒的方法，具体地涉及一种基于CRISPR技术检测甘薯G病毒或甘薯病害的方法，所述方法包括利用gRNA、Cas蛋白和单链核酸检测器进行检测的步骤；本发明专利技术通过对gRNA的筛选和优化，提高了检测效率，具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
ID No.1的互补序列的连续30个碱基互补配对。
[0014]在更优选的实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列如SEQ ID No.3
‑
7任一所示。
[0015]在一个实施方式中，所述Cas蛋白选自V型Cas蛋白，例如，Cas12、Cas14家族蛋白或其突变体。
[0016]在一个实施方式中，所述Cas蛋白优选为Cas12家族，包括但不限于Cas12a、Cas12b、Cas12d、Cas12e、Cas12f、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Cas12j中的一种或任意几种。
[0017]优选的，所述与Cas蛋白结合的区域的序列如SEQ ID No.8所示。
[0018]另一方面，本专利技术提供了一种检测/诊断甘薯G病毒或甘薯病害的方法，所述方法包括将待测核酸与V型Cas蛋白、上述gRNA和单链核酸检测器接触；检测由Cas蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而检测/诊断甘薯G病毒或甘薯病害。
[0019]进一步的，所述方法还包括从待测样品中获得待测核酸的步骤；优选的，采用扩增的方法从待测样品中获得待测核酸。
[0020]进一步的，所述方法还包括采用引物对进行扩增获得待测核酸的步骤。
[0021]所述引物对的上游引物如SEQ ID NO：9
‑
14任一所示，所述引物对的下游引物如SEQ ID NO：15
‑
20任一所示。
[0022]在一个实施方式中，所述引物对选自下组任意一种或其组合：
[0023]i、引物对的上游引物如SEQ ID No.9所示，所述引物对的下游引物如SEQ ID No.15所示；
[0024]ii、引物对的上游引物如SEQ ID No.10所示，所述引物对的下游引物如SEQ ID No.16所示；
[0025]iii、引物对的上游引物如SEQ ID No.11所示，所述引物对的下游引物如SEQ ID No.17所示；
[0026]iv、引物对的上游引物如SEQ ID No.12所示，所述引物对的下游引物如SEQ ID No.18所示；
[0027]v、引物对的上游引物如SEQ ID No.13所示，所述引物对的下游引物如SEQ ID No.19所示；
[0028]vi、引物对的上游引物如SEQ ID No.14所示，所述引物对的下游引物如SEQ ID No.20所示；
[0029]优选的，引物对的上游引物如SEQ ID NO：14所示，所述引物对的下游引物如SEQ ID NO：20所示。
[0030]本专利技术中，所述待测核酸可以是双链核酸，也可以是单链核酸。
[0031]本专利技术所述扩增选自PCR、基于核酸测序的扩增(NASBA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、环介导的等温扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、或切口酶扩增反应(NEAR)、多重置换扩增(MDA)、滚环扩增(RCA)、连接酶链反应(LCR)、或衍生物扩增方法(RAM)中的一种或任意几种。
[0032]本专利技术中，所述样品可以为来自植物的样品，例如，甘薯、莲藕、马铃薯、巴西牵牛、日本牵牛、普通牵牛、苋色藜、大豆、菠菜、黄瓜、南瓜、茄子、番茄；其他的实施方式中，所述样品还可以来自其他植物，例如，烟草、甜菜、芸苔、茴藜、瓠果、曼陀罗、千日红、心叶烟、菜
豆、萝卜、豇豆。
[0033]在一个实施方式中，所述样品可以为植物的传毒介质，例如，薯苗、营养繁殖体、薯块、蚜虫、棉蚜、扁豆蚜、芥菜脂蚜、桃蚜、烟粉虱、机械接种物、嫁接物、种子、花粉样品。
[0034]在其他的实施方式中，所述样品还可以来源于环境样品，例如，空气、水体、土壤等。
[0035]另一方面，本专利技术提供了一种检测/诊断甘薯G病毒的组合物，所述组合物包括上述gRNA，还包括Cas蛋白以及单链核酸检测器；优选的，还包括上述引物对。
[0036]另一方面，本专利技术还提供了一种用于检测或诊断待测植物是否感染甘薯病害的系统、组合物或试剂盒，所述系统、组合物或试剂盒包括V型Cas蛋白、上述gRNA和单链核酸检测器。进一步的，所述系统、组合物或试剂盒还包括扩增引物；优选的，所述扩增引物包括上述引物对。
[0037]另一方面，本专利技术还提供了上述用于检测或诊断待测植物是否感染甘薯病害的组合物在诊断或检测甘薯病害中的用途，或者在用于制备诊断或检测甘薯病害的试剂或试剂盒中的用途。
[0038]另一方面，本专利技术还提供了一种用于检测/诊断甘薯G病毒的系统、组合物或试剂盒，所述系统、组合物或试剂盒包括V型Cas蛋白、上述gRNA(指导RNA)和单链核酸检测器；优选的，还包括上述引物对。
[0039]另一方面，本专利技术还提供了上述系统、组合物或试剂盒在检测/诊断甘薯G病毒中的应用。
[0040]另一方面，本专利技术还提供了上述组合物在制备检测/诊断甘薯G病毒的试剂或试剂盒中的用途。
[0041]进一步的，所述V型Cas蛋白选自Cas12、Cas14家族蛋白或其突变体。
[0042]在一个实施方式中，所述Cas蛋白优选为Cas12家族，包括但不限于Cas12a、Cas12b、Cas12d、Cas12e、Cas12f、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Cas12j中的一种或任意几种。
[0043]在一个实施方式中，所述Cas12a选自FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a或Lb4Cas12a中一种或任意几种。
[0044]在优选的实施方式中，所述Cas12i蛋白的氨基酸序列选自下组：
[0045](1)SEQ ID NO：2所示的蛋白；
[0046](2)将SEQ ID NO：2所示氨基酸序或其活性片段经过一个或多个(如2个、3个、4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有基本相同功能的衍生蛋白；
[0047](3)与SEQ ID NO：2具有至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，或至少99％的序列同一性的，且具有trans活性的蛋白。
[0048]在一个实施方式中，所述Cas蛋白突变体包括氨基酸取代、缺失或替换，且所述突变体至少保留其trans切割活性。优选地，所述突变体具有Cis和trans切割活性。
[0049]本专利技术中，所述单链核酸检测器包括单链DNA、单链RNA或者单链DNA
‑
RNA杂交体。在其他的实施方式中，所述单链核酸检测器包括单链DNA、单链RNA或者单链DNA
‑
RNA杂交体的任意两种或三种的混合物，例如，单链DNA和单链RNA的组合物、单链DNA和单链DNA
‑
RNA杂
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测甘薯G病毒的gRNA，所述gRNA包括与V型Cas蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列，所述靶核酸为来源于甘薯G病毒的核酸；其特征在于，所述与靶核酸杂交的导向序列选自下组任意一种或其组合：(1)所述与靶核酸杂交的导向序列含有20
‑
30个碱基，并且与SEQ ID No.1所示的序列或其反向互补序列杂交，并且所述导向序列包含SEQ ID No.3
‑
7任一所示的序列；(2)所述与靶核酸杂交的导向序列包含SEQ ID No.3
‑
7任一所示的序列，并且在SEQ ID No.3
‑
7任一所示的序列的3
’
端还包括1
‑
10个碱基，并且，所述与靶核酸杂交的导向序列与SEQ ID No.1所示的序列或其反向互补序列杂交；(3)所述与靶核酸杂交的导向序列与SEQ ID No.3
‑
7任一所示的序列相比，在SEQ ID No.3
‑
7任一所示的序列的3
’
端连续缺失1
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5个碱基；(4)所述与靶核酸杂交的导向序列如SEQ ID No.3
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7任一所示。2.一种检测/诊断甘薯G病毒或甘薯病害的方法，所述方法包括将待测核酸与V型Cas蛋白、权利要求1所述的gRNA和单链核酸检测器接触；检测由Cas蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而检测/诊断甘薯G病毒或甘薯病害。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括从待测...

【专利技术属性】
技术研发人员：王丽梅，赵莹，
申请(专利权)人：山东舜丰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：