一种检测EGFR基因L858R和DelE746-A750突变的试剂及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测EGFR基因L858R和Del E746

【技术实现步骤摘要】
一种检测EGFR基因L858R和Del E746
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A750突变的试剂及其应用


[0001]本专利技术属于生物技术及医学领域，具体涉及一种检测EGFR基因L858R和Del E746
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A750突变的试剂及其应用。

技术介绍

[0002]表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)基因位于人类7号染色体短臂上，有28个外显子。EGFR编码蛋白是一种跨膜糖蛋白，该蛋白是由1186个氨基酸组成，具有络氨酸激酶(tyrosine kinase，TK)活性，广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞和角细胞等细胞表面。正常情况下，作为细胞表面蛋白可与配体如表皮生长因子EGF(epidermal growth factor)结合，EGFR可被激活，由单体转化为二聚体以及发生自体络氨酸磷酸化，激活后的EGFR可以再磷酸化下游蛋白，对细胞的生长、增殖和分化等生理生化过程起着重要的调控作用。然而，当EGFR基因发生突变，EGFR基因就会过量表达EGFR蛋白并组装到细胞膜表面，导致表皮生长因子受体过多，EGF与EGFR的过多结合，导致细胞发生异常生长和分裂，最终发生癌变。
[0003]EGFR基因突变主要发生在TK区域的前四个外显子上面，一般突变有三种类型，分别是缺失突变、替代突变、复制或插入突变。其中，缺失突变主要发生在外显子19上，最常见的是del E746
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A750，替代突变主要发生在外显子21上的L858R，这两种突变约占突变的90％，所以对于EGFR基因的突变研究，这两者突变的检测至关重要。对于肿瘤患者的肿瘤基因获取一般来源于组织样本，但是晚期的肺癌患者组织样本不易获取。相关研究发现，在肺癌患者晚期的外周血中发现有来自于肿瘤组织的游离DNA，所以，可以通过对外周血进行EGFR基因的突变检测。EGFR的突变检测目的主要是为了根据患者的自身情况进行个性化治疗，达到最大的治疗效果。
[0004]目前对EGFR突变检测手段主要包括测序法与ARMS方法。相关文献报道比较了两种方法的优缺点，测序法的灵敏度低，大约为25％，同时该方法的检测流程复杂、速度慢，同时对分析要求高，仪器成本高，检测试剂成本相对来说低；ARMS方法的灵敏度较高为1％，其检测流程简单，速度快，数据分析要求低，仪器成本低，但是ARMS检测的费用成本高，是由于该方法检测使用的探针需要进行荧光修饰，修饰的费用平均为300元人民币/条，平均一个位点单次反应检测成本需要20元人民币。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种检测EGFR基因L858R和Del E746
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A750突变的试剂，能够准确、快速、低成本的检测表皮生长因子受体基因的突变率。
[0006]本专利技术还提出上述试剂的应用。
[0007]本专利技术还提出一种检测EGFR基因L858R和Del E746
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A750突变的试剂盒。
[0008]本专利技术还提出上述试剂盒的应用。
[0009]本专利技术还提出一种检测EGFR基因L858R和Del E746
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A750突变的方法。
[0010]根据本专利技术的一个方面，提出了一种检测EGFR基因L858R和Del E746
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A750突变的试剂，所述试剂包括序列如SEQ ID No.1及SEQ ID No.3所示的第一引物对及序列如SEQ ID No.4及SEQ ID No.5所示的第二引物对。
[0011]在本专利技术的一些实施方式中，所述所述试剂还包括序列如SEQ ID No.6所示的第一荧光探针和SEQ ID No.7所示的第一猝灭探针和序列如SEQ ID No.8所示的第二荧光探针和SEQ ID No.9所示的第二猝灭探针。
[0012]在本专利技术的一些实施方式中，所述第一荧光探针、第二荧光探针均独立地于5
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端结合荧光基团；所述第一猝灭探针、第二猝灭探针均独立的于3
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端结合淬灭基团。
[0013]在本专利技术的一些实施方式中，所述荧光基团包括FAM、VIC、JOE或HEX。
[0014]在本专利技术的一些实施方式中，所述淬灭基团包括NFQ、TAMRA、BHQ或IABkFQ。
[0015]在本专利技术的一些实施方式中，所述淬灭基团为BHQ。
[0016]在本专利技术的一些实施方式中，所述第一引物对和所述第一荧光探针和所述第一猝灭探针用于检测EGFR基因19号外显子的del E746
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A750突变；所述第二引物对和所述第二荧光探针和所述第二猝灭探针用于检测EGFR基因21号外显子的L858R突变。
[0017]根据本专利技术第二方面实施方式的上述试剂的应用，所述试剂在检测EGFR基因的突变中的应用。
[0018]在本专利技术的一些实施方式中，所述试剂在检测EGFR基因L858R和Del E746
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A750突变中的应用。
[0019]根据本专利技术第三方面的一种检测L858R和Del E746
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A750突变的试剂盒，所述试剂盒包括上述试剂。
[0020]在本专利技术的一些实施方式中，所述试剂还包括KPbuffer。
[0021]在本专利技术的一些实施方式中，所述试剂盒在检测EGFR基因L858R和Del E746
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A750突变中的应用。
[0022]根据本专利技术的一些实施方式，所述试剂盒在制备肺癌检测试剂中的应用。
[0023]一种应用上述引物组合物或上述试剂或上述试剂盒检测EGFR基因L858R和Del E746
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A750突变率的方法，包括以下步骤：将从全血样本中提取的DNA样本与上述引物组合物或上述试剂进行QPCR反应，对从全血样本中提取的EGFR基因进行PCR扩增根据CT值和熔点曲线来检测是否有突变发生，所述方法不以疾病的诊断或治疗为目的。
[0024]在本专利技术的一些实施方式中，所述特异性荧光探针5
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端标有荧光发光基团，3
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端有荧光淬灭基团BHQ1，在探针完整时，两基团在空间结构上距离相互靠近，5
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端报告基团发出的荧光因为荧光共振能量转移(FRET)而被3
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端淬灭基团淬灭，所以体系中没有荧光信号的变化。而一旦它与突变后的模板特异性的结合，其结合位点在两条引物之间，随着引物的延伸，Taq DNA聚合酶在链延伸过程中遇到与模板相结合的探针，其5
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外切酶活性就会将探针切断，荧光报告基团远离荧光淬灭基团，这样就破坏了两荧光基团之间的FRET，报告基团所释放出来的荧光就可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测到。PCR每经过一个循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程，荧光信号的强弱就代表了模本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测EGFR基因L858R和Del E746
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A750突变的试剂，其特征在于，所述试剂包括序列如SEQ ID No.1及SEQ ID No.3所示的第一引物对及序列如SEQ ID No.4及SEQ ID No.5所示的第二引物对。2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂还包括序列如SEQ ID No.6所示的第一荧光探针和SEQ ID No.7所示的第一猝灭探针和序列如SEQ ID No.8所示的第二荧光探针和SEQ ID No.9所示的第二猝灭探针。3.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述第一引物对、第一荧光探针和第一猝灭探针用于检测EGFR基因19号外显子的del E746
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A750突变；所述第二引物对、第二荧光探针和第二猝灭探针用于检测EGFR基因21号外显子的L858R突变。4.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，第一引物对和所述第二引物对的荧光标记序列不同。5.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，第一荧光探针、第二荧光探针均独立地于5
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【专利技术属性】
技术研发人员：黄文静，袁梦兮，聂秋宇，朱碧银，王晓锋，赵鑫，王益民，
申请(专利权)人：人和未来生物科技长沙有限公司，
类型：发明
国别省市：