基于液滴微流控的高效率定量线粒体转移的系统与方法技术方案

一种基于液滴微流控以定量控制线粒体转移的系统，其包括用于生成含有游离线粒体和单细胞的液滴的生成模块；用于在显微镜下观察生成液滴的观察模块；以及用于收集生成的液滴的收集模块

【技术实现步骤摘要】
基于液滴微流控的高效率定量线粒体转移的系统与方法


[0001]本专利技术涉及基于液滴微流控系统进行线粒体转移，更具体地说，涉及基于液滴微流控系统的高效率定量线粒体转移
。

技术介绍

[0002]突变型与野生型线粒体
DNA(mtDNA)
的比率称为异质性系数，此系数决定了线粒体相关病症的严重程度
。
在肌肉组织中，当异质性系数超过一定水平或线粒体功能失调时，会产生较少的
ATP
和过量的活性氧
(ROS)
，进而引发肌肉萎缩
、
无力和耐力丧失
。
先前的临床和临床前动物研究显示，线粒体损伤的增加与不良的骨骼肌健康状况之间存在联系
。
自二十世纪
90
年代以来，细胞疗法
(
特别是成肌细胞移植
)
已被提出用于改善受伤骨骼肌的再生，然而，成肌细胞移植的早期临床试验结果大多显示失败，主要是由于宿主免疫细胞
(
如
CD8+T
淋巴细胞
)
的存在，而导致大量细胞死亡，免疫细胞的积累不但会造成肌膜损伤和激活肌纤维中的胱天蛋白酶3，还会进一步诱导肌纤维的凋亡
。
因此，需要开发新的治疗骨骼肌病症的方法，例如调节巨噬细胞和化学诱导干细胞，而如何恢复或改善线粒体功能以促进肌肉再生是具有吸引力的方法
。
[0003]除了为细胞产生能量外，线粒体也与细胞增殖
、
衰老<br/>、
凋亡
、
先天免疫
、
钙稳态
、
甚至干细胞分化潜力相关
。mtDNA
的突变会损害细胞和组织的功能，在自然界中，自发性的线粒体转移可以通过不同的机制在健康细胞和受损细胞之间发生，以保护受损细胞并恢复其细胞功能
。
线粒体转移是一种改变细胞中
mtDNA
的技术，自从
Clark
和
Shay
首次公开后，引起了越来越多的关注
。
线粒体转移目前已被用于治疗
mtDNA
相关疾病的细胞疗法，相较于其他修改线粒体基因组的技术，如
mitoZFNs
和
mitoTALENs
，线粒体转移更容易执行并且实际上更有效，透过将外源线粒体转移到受体细胞中可以降低突变型与野生型
mtDNA
的比率，并恢复或改善细胞和组织的功能
。
先前的研究显示，可以通过共培养或显微注射的方式将外源的游离线粒体递送至细胞中，在与游离线粒体共培养的方法中，受体细胞通过内吞作用吞噬游离的线粒体，内吞作用是一种从周围环境中摄取纳米到数微米的物体的细胞活动，游离的线粒体在受体细胞周围随机移动，当接触到细胞时有机会被细胞吞噬，因此这种现象是一种随机和偶发的过程，共培养方法的转移效率受细胞外游离的线粒体数量的影响，尽管在先前的研究中，最高可以达到
28
％，但即使在等量的游离线粒体的情况下，转移进细胞的线粒体数量也是相当不平均的
(
有的受体细胞有1个而有的受体细胞有
60
个
)
，尽管共培养方法是一个相当简单的过程，但其是否成功取决于许多不可控的因素，这也可能是先前试验中受体细胞的细胞代谢恢复率不理想
(
约
0.2
％
)
的潜在原因之一
。
为了减少不可控因素的影响，基于自动化光镊的操纵系统
(
基于
OT
的操纵系统
)
被用于进行线粒体质量和数量可控的线粒体转移，基于
OT
的操纵系统可以精确地获取健康的线粒体，并将它们运送到目标受体细胞
。
然而，这种方法存在通量低的限制，这使得基于
OT
的操纵系统难以用于临床应用
。
[0004]与共培养方法不同，显微注射是将预装在微针中的游离线粒体直接注射到受体细
胞中；因此，由于在递送过程中必需打开细胞膜，可能会对受体细胞造成损害
。
此外，显微注射技术的通量也很低
。
[0005]上述方法为研究线粒体转移后细胞功能的恢复或改善机制提供了有用的技术方案，然而，它们仍然不能满足细胞疗法行业对转进了线粒体的细胞的大量需求
。
共培养技术由于无害而具有相当大的优势，但其低效率和异质性仍是一个主要瓶颈
。
[0006]液滴微流控是一种将携带化学试剂
、
细胞或其他生物材料的连续流分散到微米级的离散体积
(
称为液滴
)
中的技术，这些液滴是进一步进行化学反应
、
细胞生命活动
、
目标检测和材料合成的基本单位
。
液滴微流控比大体积的分析方法提供了更小且受限制的环境，因此可以更快速地反应和检测分子
/
颗粒以及与包裹细胞的相互作用
。
先前的研究已经证明，液滴生成速率可高达每秒数千个液滴，这使得液滴微流控在本质上是属于一种高通量技术
。
液滴微流控的一个重要应用是单细胞分析，其中单个细胞被包裹在一个液滴中，用于分析细胞生命活动或进行细胞修饰，如抗体分析或基因编辑
。
[0007]美国专利申请公开号
2017/159017A1
，名称为：“将外源线粒体引入哺乳动物细胞的方法
(Method for introducing exogenous mitochondria into a mammalian cell)”和美国专利美国专利申请公开号
2013/149778A1
，名称为：“肽介导的线粒体递送系统的方法和应用
(Method and Applications of Peptide
‑
Mediated Mitochondrial Delivery System)”，应用天然细胞膜吞噬过程
(
也称为内吞作用
)
来转移游离的线粒体
。
[0008]美国专利申请公开号
2019/276852A1
，名称为：“将外源线粒体递送到细胞中的方法
(Method for delivering exogenous mitochondria into cells)”和欧洲专利申请公开号
EP3169338A1
，名称为：“受体细胞中游离的线粒体的细胞间转移方法
(Methods for the intercellular transfer of isolated mitochondria in recipient cells)”，应用离心法转移线粒体
。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种基于液滴微流控的线粒体转移定量控制系统，其特征在于，所述基于液滴微流控的线粒体转移定量控制系统包括：生成含有游离线粒体和单细胞的液滴的生成模块；在显微镜下观察生成的液滴的观察模块；以及收集所述生成的液滴的收集模块
。2.
根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述液滴生成模块和液滴观察模块透过导管连接
。3.
根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述液滴生成模块包括三个入口
。4.
根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述液滴生成模块进一步包括线粒体受体细胞悬浮液
、
游离线粒体悬浮液以及添加了表面活性剂的氟化油，其中所述线粒体受体细胞为受体
C2C12
细胞
。5.
根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述液滴生成模块包括流动聚焦结构，其中所述流动聚焦结构可将所述线...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙东，孙佳宇，
申请(专利权)人：香港城市大学深圳研究院，
类型：发明
国别省市：