一种猪毛乳头细胞的培养方法技术

本发明专利技术涉及一种猪毛乳头细胞的培养方法，所述猪毛乳头细胞取自猪耳皮肤组织，采用Ⅰ型胶原酶、胰酶进行消化分离，采用胎牛血清培养基加入鼠尾胶原进行细胞培养。采用本发明专利技术提供的方法，表皮与真皮结构易于区分，毛囊结构清晰分明，易于分离，缩短了细胞传代时间13小时左右，并且贴壁更牢。本发明专利技术提供的方法可以使猪毛乳头细胞在7代以内保持毛乳头细胞特性且纯度高，因此可批量获得高纯度且传代一致性较好的猪毛乳头细胞。

【技术实现步骤摘要】
一种猪毛乳头细胞的培养方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种猪毛乳头细胞的培养方法。
技术介绍
毛囊是皮肤最为重要的附属器官，其发育涉及外胚层和中胚层的相互作用。毛囊的周期性循环再生长(生长期、退化期和静止期的周期性循环)的特性导致新毛发的生长与旧毛发的脱落。当毛囊的周期性再生功能发生异常时，会导致脱发、多毛症和毛干疾病等毛囊疾病。随着社会的发展，人们对影响生活与工作的毛发越来越重视，对毛囊周期性发育的研究变得越来越重要。目前，对于脱发问题有效的解决方法是进行毛发移植手术，由于毛发移植是对原有毛囊的重新分配和布局，并没有产生新的毛囊，所以不适于较大面积毛发缺失的治疗。如果能够诱导出新的毛囊，尤其能够在体外构建出毛囊的话，那么这一问题将迎刃而解。其中，毛乳头是毛囊的重要组成部分，在毛囊的形成、发育和毛囊周期的调控当中是不可或缺的，其分泌的多种细胞因子、生长因子可通过异种移植等手段，在体外条件下进行诱导毛囊的重建过程。因此，在体外对毛乳头细胞进行培养对研究脱发问题具有重要意义。在人类毛囊问题的研究上，最理想的材料为人毛乳头细胞。但人毛乳头细胞来源有限，制约其进一步研究。羊和兔的毛囊发育涉及到初级毛囊和次级毛囊的发育，与人类毛囊发育存在区别，并不适用。猪的毛囊发育不涉及到次级毛囊的发育，且相较于小鼠，猪的毛囊形成阶段与人类类似，约处于妊娠周期的前三分之一时期。同时，猪的皮肤在解剖学、组织学和生理学上与人类皮肤接近，是理想的毛囊研究模式动物。相较于背部皮肤，猪耳部皮肤较薄，易于后续组织消化，耳部皮肤比较适合毛乳头细胞的分离与培养。毛乳头细胞的体外培养是深入研究毛囊生物学、真表皮相互作用机制、毛发形成-重建过程、临床各种与毛发相关的功能代谢失调疾病的关键环节和基础。要获得毛乳头细胞，首先得分离出完整的毛囊结构。毛囊由包在毛根外的上皮组织和结缔组织鞘构成。毛乳头细胞位于毛囊的底部毛球中，被一层很厚的基底膜包绕，体积小，分离困难。由于毛乳头解剖位置特别，生物学特征明显，贴壁困难等，高纯度的毛乳头细胞较难获得，制约了毛囊生物学的研究进展。毛乳头细胞的传统分离方法为采用显微切割的方式，但此方法劳动强度大、易使操作者疲劳、增大细菌污染几率且获得的细胞数量较少，而且分离出的毛乳头细胞被基底膜包被而难以贴壁且迁出速度慢。现在常用的酶消化法可以批量获得毛乳头细胞，但由于毛囊周期发育模式和不同部位皮肤厚度的差异等，使得在不同物种的不同部位对毛乳头细胞进行提取和培养的方法存在显著差异，而且采用不同培养条件，会影响毛乳头细胞的传代时间。目前已经建立的毛乳头细胞培养方法，主要是针对毛用动物的，而毛用动物的毛乳头与人类差异巨大，并不适用于人类毛囊科学的研究需求，而针对猪的毛乳头细胞培养方法还未真正建立，并不能批量提供高纯度的毛乳头细胞以供研究，因此，亟需提供一种适合猪耳组织进行纯度高的毛乳头细胞的提取和培养方法，为进一步分析和研究人类毛囊疾病奠定基础。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供一种猪毛乳头细胞的培养方法，旨在批量获得高纯度的猪毛乳头细胞。本专利技术提供的一种猪毛乳头细胞的培养方法，所述猪毛乳头细胞取自猪耳皮肤组织，所述猪耳皮肤组织来自屠宰后半小时内猪只耳朵较薄部位的皮肤组织，所剪取的耳样大小要在不卷曲的情况下可置于离心管中，并用生理盐水浸没，8-10小时内完成猪毛乳头细胞分离培养操作；有关毛乳头细胞的培养方法具体包括如下步骤：所述猪毛乳头细胞取自上述耳样，具体包括如下步骤：S1、将耳样从生理盐水中取出，将耳样皮肤剪成1.5cm*4cm状长条，在生理盐水中清洗，刮去表面脏物，随后放到碘伏溶液中清洗2min；再放到生理盐水中清洗，然后放到75％酒精溶液中进行清洗2min；再一次将耳样放到生理盐水中清洗，然后放到PBS中进行清洗2min，最后放到生理盐水中清洗干净；S2、将S1处理好的耳样边缘部分剪掉弃之，先去掉表皮长毛的部分，再去掉表皮层和软骨，将剩余组织剪成米粒大小的组织颗粒；S3、将S2获得的组织颗粒置于离心管中，加入Ⅰ型胶原酶，使其浸没上述组织颗粒，37℃消化4-5h，每间隔10-15min吹打，并摇晃样品；S4、消化4-5小时后，加入胎牛血清培养基终止消化，1200r/min离心5min，弃掉上层液体；S5、在S4步骤获得的离心管中加入0.25％胰酶进行消化10-20min，加入胎牛血清培养基终止消化；S6、将上述混合物转移到培养皿中，并放到显微镜下观察，挑选完整的毛乳头，放到另一新的培养皿中，新的培养皿要预先加入胎牛血清培养基；S7、在显微镜下利用5mm针头对上述培养皿中毛乳头周围粘连部分进行清除；S8、对S7中的毛乳头进行挑选，转移至装有DMEM培养基的新培养皿中，并用DMEM培养基对其清洗2-3次；S9、将S8处理好的毛乳头均匀的贴附于预先铺有鼠尾胶原的6孔细胞培养板中，所述细胞培养板的培养孔内要预先加入少量胎牛血清培养基，待毛乳头贴壁再加入1mL胎牛血清培养基，所述毛乳头从贴附到贴壁需要约24小时；S10、将上述毛乳头留置上述细胞培养板中培养一周后可进行正常传代，传代时间为49-50h。进一步，所述Ⅰ型胶原酶浓度为1.5mg/mL，配制方法为：在37℃条件下，将Ⅰ型胶原酶溶于TESCA缓冲液中，然后分装保存于-20℃。进一步，所述鼠尾胶原溶液浓度为1mg/mL，配制方法为：取5mL0.1mol/L的醋酸溶液加入到15mL的离心管中，加入5mg的鼠尾胶原，在室温下持续搅拌1-3小时直至溶解，配制成1mg/mL的鼠尾胶原溶液。进一步，所述胎牛血清培养基的配制方法为：在DMEM基础培养基中加入15％胎牛血清。1、本专利技术确定了适用于猪毛乳头消化分离的方式：采用酶消化法对皮肤组织进行消化时，现有技术常使用分散酶Ⅱ、I型胶原酶、胰酶、和D型胶原酶结合的方式等。分散酶Ⅱ是一种非特异性的金属蛋白酶，被用来消化细胞外基质，释放并制备原代单细胞。I型胶原酶是一种肽链内切酶，可降解天然胶原纤维，适用于上皮细胞等的制备。胰酶是一种多种酶混合物，用于组织细胞体外培养、组织细胞分散和细胞传代培养等。D型胶原酶用于分离组织和原代细胞的培养，适用于当细胞表面蛋白质的功能和完整性很重要的情况。本专利技术采用分散酶Ⅱ、I型胶原酶和胰酶和一定时间梯度进行预试验。使用常用的分散酶Ⅱ对耳组织进行13-15h过夜消化，发现使用该酶后，组织分层效果好，但毛囊剥离的效果差，出现不完整毛囊(图1)。因此，本专利技术不再使用该酶。在对剪碎后的耳样使用I型胶原酶消化1h后，碎耳样组织未出现明显变化；消化2h后，碎耳样组织变得较为松软，但整体结构无太大变化；消化3h后，耳样组织变松软，整体结构有较大变化；消化4h后，耳样组织质地粘稠，组织出现分层，有较完整毛囊出现；消化5h后，出现过度消化痕迹，毛囊结构模糊，出现较多不完整毛囊；消化6h后，毛囊结构无法区分。综上，选取4-5h为I型胶原酶适当的消化时间。仅使用胶原酶后对毛乳头进行挑取，发现本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪毛乳头细胞的培养方法，其特征在于，所述猪毛乳头细胞取自猪耳皮肤组织，所述猪耳皮肤组织来自屠宰后半小时内猪只耳朵较薄部位的皮肤组织，在不卷曲的情况下置于离心管中，并用生理盐水浸没，8-10小时内完成猪毛乳头细胞分离培养操作；/n有关毛乳头细胞的培养方法具体包括如下步骤：所述猪毛乳头细胞取自上述耳样，具体包括如下步骤：/nS1、将耳样从生理盐水中取出，将耳样皮肤剪成1.5cm*4cm状长条，在生理盐水中清洗，刮去表面脏物，随后放到碘伏溶液中清洗2min；再放到生理盐水中清洗，然后放到75％酒精溶液中进行清洗2min；再一次将耳样放到生理盐水中清洗，然后放到PBS中进行清洗2min，最后放到生理盐水中清洗干净；/nS2、将S1处理好的耳样边缘部分剪掉弃之，先去掉表皮长毛的部分，再去掉表皮层和软骨，将剩余组织剪成米粒大小的组织颗粒；/nS3、将S2获得的组织颗粒置于离心管中，加入Ⅰ型胶原酶，使其浸没上述组织颗粒，37℃消化4-5h，每间隔10-15min吹打，并摇晃样品；/nS4、消化4-5小时后，加入胎牛血清培养基培养基终止消化，1200r/min离心5min，弃掉上层液体；/nS5、在S4步骤获得的离心管中加入0.25％胰酶进行消化10-20min，加入胎牛血清培养基终止消化；/nS6、将上述混合物转移到培养皿中，并放到显微镜下观察，挑选完整的毛乳头，放到另一新的培养皿中，新的培养皿要预先加入胎牛血清培养基；/nS7、在显微镜下利用5mm针头对上述培养皿中毛乳头周围粘连部分进行清除；/nS8、对S7中的毛乳头进行挑选，转移至装有DMEM培养基的新培养皿中，并用DMEM培养基对其清洗2-3次；/nS9、将S8处理好的毛乳头均匀的贴附于预先铺有鼠尾胶原的6孔细胞培养板中，所述细胞培养板的培养孔内要预先加入少量胎牛血清培养基，待毛乳头贴壁再加入1ml胎牛血清培养基，所述毛乳头从贴附到贴壁需要约24小时；/nS10、将上述毛乳头留置上述细胞培养板中培养一周后可进行正常传代，传代时间为49-50h。/n...

【技术特征摘要】
1.一种猪毛乳头细胞的培养方法，其特征在于，所述猪毛乳头细胞取自猪耳皮肤组织，所述猪耳皮肤组织来自屠宰后半小时内猪只耳朵较薄部位的皮肤组织，在不卷曲的情况下置于离心管中，并用生理盐水浸没，8-10小时内完成猪毛乳头细胞分离培养操作；
有关毛乳头细胞的培养方法具体包括如下步骤：所述猪毛乳头细胞取自上述耳样，具体包括如下步骤：
S1、将耳样从生理盐水中取出，将耳样皮肤剪成1.5cm*4cm状长条，在生理盐水中清洗，刮去表面脏物，随后放到碘伏溶液中清洗2min；再放到生理盐水中清洗，然后放到75％酒精溶液中进行清洗2min；再一次将耳样放到生理盐水中清洗，然后放到PBS中进行清洗2min，最后放到生理盐水中清洗干净；
S2、将S1处理好的耳样边缘部分剪掉弃之，先去掉表皮长毛的部分，再去掉表皮层和软骨，将剩余组织剪成米粒大小的组织颗粒；
S3、将S2获得的组织颗粒置于离心管中，加入Ⅰ型胶原酶，使其浸没上述组织颗粒，37℃消化4-5h，每间隔10-15min吹打，并摇晃样品；
S4、消化4-5小时后，加入胎牛血清培养基培养基终止消化，1200r/min离心5min，弃掉上层液体；
S5、在S4步骤获得的离心管中加入0.25％胰酶进行消化10-20min，加入胎牛血清培养基终止消化；
S6、将上述混合物转移到培养皿中，并放到显微镜下观察，挑选完整的毛乳头，放...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁向东，秦晋，邹全，蒋尧，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11