一种3D婴儿皮肤等效评估模型的建立与评估方法技术

本发明专利技术公开了一种3D婴儿皮肤等效评估模型的建立与评估方法。一种3D婴儿皮肤等效评估模型，是通过从接受整形手术的婴儿捐赠者(2岁以下)获得的健康皮肤活组织，建立了正常人真皮成纤维细胞和表皮角质形成细胞的原代培养模型；具有自然婴儿皮肤特点，可以作为3D全层婴儿皮肤功效测评模型。对婴儿皮肤模型中的多个指标如：丝聚合蛋白、克劳丁‑1(claudin‑1)、半胱氨酸蛋白酶‑14(caspase‑14)和透明质酸进行了组织学和免疫病理学分析；考察活性物组分治疗对婴儿皮肤模型中IL‑6浓度的影响，表明活性物有没有炎症刺激；可以帮助验证和筛选出对婴儿皮肤有强化屏障功能，保湿，修复功效的活性成分。

【技术实现步骤摘要】
一种3D婴儿皮肤等效评估模型的建立与评估方法
本专利技术涉及一种日用化学品
，特别是涉及一种3D婴儿皮肤等效评估模型建立与功效评估方法和应用。
技术介绍
婴儿的皮肤在结构、功能和组成上与成人皮肤不同，使婴儿的皮肤比成人皮肤更细腻和脆弱。婴儿皮肤的阻隔功能以及水保持和运输特性已经证明与成人不同，并且一直贯穿于生命的生长过程中。发现婴儿皮肤在休息时含水量较高，透水率较高，吸收更多水分，并比成人皮肤更快地吸收多余的水。随着婴儿皮肤在生命的最初几年不断变化，需要用适当的护肤品解决其动态特性。丝聚合蛋白对于皮肤屏障是至关重要的，它可以保护身体免受外来环境物质的入侵，而外来环境物质可能会引发异常的免疫反应。丝聚合蛋白是角质层的主要结构蛋白，这是表示在终末分化角质化细胞、最外层的表皮和透明角质颗粒的主要成分在颗粒层。中间丝相关蛋白的关键作用在表皮功能是常见的皮肤致病基因的重要性和过敏性疾病。它被认为是终末表皮分化的共同标志。肌肤紧密连接和claudin-1对皮肤屏障功能很重要。在MikioFuruse的研究中，claudin-1缺陷小鼠本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种3D婴儿皮肤等效评估模型的建立与评估方法，其特征在于：所述婴儿皮肤模型中具有下列指标：/n丝聚合蛋白、克劳丁-1、半胱氨酸蛋白酶-14和透明质酸进行了组织学和免疫病理学分析；考察活性物组分治疗对婴儿皮肤模型中IL-6浓度的影响，表明活性物有没有炎症刺激；/n该3D婴儿皮肤等效评估模型的建立与评估方法，具体包括如下步骤：/n1)细胞分离，根据法国法规(DC No.2014-2281)包含向研究部申报，通过从接受整形手术的2岁以下婴儿捐赠者获得的健康皮肤活组织，建立了正常人真皮成纤维细胞和表皮角质形成细胞的原代培养；/n2)细胞毒性研究，正常人真皮成纤维细胞被试种并播种到96孔板，密度为1...

【技术特征摘要】
1.一种3D婴儿皮肤等效评估模型的建立与评估方法，其特征在于：所述婴儿皮肤模型中具有下列指标：
丝聚合蛋白、克劳丁-1、半胱氨酸蛋白酶-14和透明质酸进行了组织学和免疫病理学分析；考察活性物组分治疗对婴儿皮肤模型中IL-6浓度的影响，表明活性物有没有炎症刺激；
该3D婴儿皮肤等效评估模型的建立与评估方法，具体包括如下步骤：
1)细胞分离，根据法国法规(DCNo.2014-2281)包含向研究部申报，通过从接受整形手术的2岁以下婴儿捐赠者获得的健康皮肤活组织，建立了正常人真皮成纤维细胞和表皮角质形成细胞的原代培养；
2)细胞毒性研究，正常人真皮成纤维细胞被试种并播种到96孔板，密度为10,000个细胞/孔，并培养成皮肤基质；表皮角质形成细胞被试种并播种到48孔板，密度为20,000个细胞/孔，并培养成皮肤基质；
然后应用活性成分组合，并进行细胞存活率分析测定，与0.5mg/mlMTT接触3小时，然后用100μl二甲基亚砜稀释甲瓒晶体持续搅拌30分钟；
对于每种情况，每个细胞类型至少处理8个孔；测试550nm的吸光度后，计算每种条件下相对于代表100％存活率的未处理对照的存活率百分比；
3)体外婴儿皮肤模型培养，在第0天将婴儿皮肤中的NHDF接种到真皮基质中；然后将真皮等效物浸泡培养21天；第21天，将婴儿皮肤中的NHEK接种在真皮顶部；这些皮肤等效物在浸泡中生长一周，然后被提升到空气/液体界面，使表皮分化；从第7天到第42天，在2种浓度的细胞培养基中溶解的护肤成分存在下培养重建皮肤样品；这项研究是在没有活性成分的正常培养基中生长的重建皮肤进行比较；在第42天进行样本采集；样品固定于4％福尔马林缓冲液中，石蜡包埋或冷冻包埋于OCT复合物中；
4)组织学分析：石蜡包埋福尔马林固定标本切成5μm切片；脱蜡和复水后，切片用Hematoxylin-Phloxin-Safran染色进行常规组织学检查；每种情况取3个样品；
固定在福尔马林和(OCT)中进行组织学和免疫组化，以评估表皮组织及其与真皮的锚定；
5)石蜡包埋福尔马林固定的5μm标本进行免疫组化染色，脱蜡和抗原暴露后，切片与含4％BSA的PBS孵育以阻断非特异性抗原键；然后将切片与一级抗体兔抗caspase-14一起孵育；将与Alexa-568(分子探针，Invitrogen)结合的二级兔抗体在室温下培养1小时；利用美国马萨诸塞州赛默飞世尔科学公司的Hoechst系统地进行了细胞核复染；
对于透明质酸，在5μm厚的石蜡切片上进行染色；非特异性位点饱和含4％BSA的PBS；切片用生物素化透明质酸结合蛋白溶液培养过夜；在用生物素化碱性磷酸酶溶液与亲和素ABC-AP试剂盒结合后，用蓝色碱性磷酸酶底物显示抗原；然后用Biebrich红溶液对切片进行反着色；
6)荧光免疫检验法：在风干的5μm冰冻切片上进行标记；用冰丙酮固定10分钟后，切片与含有4％BSA的PBS孵育，以阻断非特异性结合；然后将切片与一级抗体丝聚合蛋白小鼠单克隆抗体、小鼠Novocastra和claudin-1小鼠单克隆抗体ThermoFisherScientific一起孵育次级Alexa-568结合抗小鼠抗体分子探针，Invitrogen在室温下培养1小时；常规使用Hoechst(美国马萨诸塞州赛默飞世尔科学公司)进行核复染；
7)IL-6免疫测定：使用现成的商业化人IL-6Elisa试剂盒进行检测，并在第42天收集的上清液上进行检测，在1：100稀释上清液上遵循制造商的说明测试；
8)使用ImageJ软件进行图像处理和分析每种情况下每个样本分析6张图像；
对于丝聚糖蛋白、Caspase-14和Claudin-1的定量，计算表皮中的红色像素，并根据每种情况下的表皮总面积进行归一化，每一张照片上的表皮都被分隔开来，每个区...

【专利技术属性】
技术研发人员：周紫燕，郭苗，周正，郭阳，张金龙，杨帆，
申请(专利权)人：湖北省麦诗特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42