基于内含子的通用克隆方法和组合物技术

本发明专利技术涉及一种产生编码目标多肽的融合多核苷酸的方法。所述方法包括以下步骤：提供第一多核苷酸和第二多核苷酸，并且使所述第一多核苷酸和第二多核苷酸与IIs型限制性内切核酸酶和连接酶在允许所述IIs型限制性内切核酸酶切割所述第一多核苷酸和第二多核苷酸并连接所得切割产物的条件下接触，从而产生编码所述目标多肽的融合多核苷酸。所述第一多核苷酸包含内含子的5'部分，并且所述第二多核苷酸包含内含子的3'部分。本发明专利技术还设想编码目标多肽的多核苷酸，其在真核宿主细胞中转录时被转录为包含至少五个内含子的转录物，所述至少五个内含子对于所述多核苷酸是异源的。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基于内含子的通用克隆方法和组合物
技术介绍
重组DNA分子和允许将多个DNA片段组装成DNA的单一连续延伸段的分子克隆方法是分子生物学、生物技术和医学研究必不可少的工具。第一个重组DNA分子是在二十世纪六十年代末，在发现限制性酶和DNA连接酶之后不久制备的。从那以后，已经开发出多种方法来加快和促进重组DNA分子的产生。通常通过操纵潜在编码DNA序列来进行蛋白质工程化。编码不同蛋白质结构域的DNA模块的定向组装对新型生物治疗形式的开发和优化至关重要。分子克隆已经从克隆单一DNA片段进步到将多个DNA组分组装成DNA的单一连续延伸段。然而，仍然需要允许产生复杂构建体的有效技术(参见Endy,Nature2005Nov24；438(7067):449-53)。特定地，需要一组标准且可靠的工程化机制来去除将遗传组分组装成更大系统期间的大量单调与意外(参见Knight,T.F.(2003).IdempotentVectorDesignforStandardAssemblyofBiobricks.DOI:1721.1/21168)。DNA模块(例如编码蛋白质结构本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产生编码目标多肽的融合多核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：/n(a1)提供第一多核苷酸，所述第一多核苷酸在5'至3'方向上包含：/n(i)编码所述目标多肽的第一部分的核酸序列，/n(ii)编码第一内含子的5'部分的核酸序列，/n(iii)对于IIs型限制性内切核酸酶的第一切割序列，以及/n(iv)对于所述IIs型限制性内切核酸酶的识别序列，其中(iii)中的所述第一切割序列与所述识别序列可操作地连接，/n(a2)提供第二多核苷酸，所述第二多核苷酸在5'至3'方向上包含：/n(i)对于所述IIs型限制性内切核酸酶的识别序列，/n(ii)对于所述IIs型限制性内切核酸酶的第二切割序列，其...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180920 EP 18306220.71.一种产生编码目标多肽的融合多核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：
(a1)提供第一多核苷酸，所述第一多核苷酸在5'至3'方向上包含：
(i)编码所述目标多肽的第一部分的核酸序列，
(ii)编码第一内含子的5'部分的核酸序列，
(iii)对于IIs型限制性内切核酸酶的第一切割序列，以及
(iv)对于所述IIs型限制性内切核酸酶的识别序列，其中(iii)中的所述第一切割序列与所述识别序列可操作地连接，
(a2)提供第二多核苷酸，所述第二多核苷酸在5'至3'方向上包含：
(i)对于所述IIs型限制性内切核酸酶的识别序列，
(ii)对于所述IIs型限制性内切核酸酶的第二切割序列，其中所述第二切割序列与所述第一切割序列互补，并且其中所述第二切割序列与(a2)(i)中的所述识别序列可操作地连接，
(iii)编码所述第一内含子的3'部分的核酸序列，
(iv)编码所述目标多肽的第二部分的核酸序列，
(v)编码第二内含子的5'部分的核酸序列，
(vi)对于所述IIs型限制性内切核酸酶的第三切割序列，其与所述第一多核苷酸的第一切割序列不同，以及
(vii)对于所述IIs型限制性内切核酸酶的识别序列，其中所述第三切割序列与(a2)(vii)中的所述识别序列可操作地连接，以及
(a3)提供第三多核苷酸，所述第三多核苷酸在5'至3'方向上包含：
(i)对于所述IIs型限制性内切核酸酶的识别序列，
(ii)对于所述IIs型限制性内切核酸酶的第四切割序列，其中所述第四切割序列与所述第三切割序列互补，其中所述第四切割序列与(a3)(i)中的所述识别序列可操作地连接，
(iii)编码所述第二内含子的3'部分的核酸序列，以及
(iv)编码所述目标多肽的第三部分的核酸序列，以及
(b)使所述第一、第二和第三多核苷酸与所述IIs型限制性内切核酸酶和连接酶在允许所述IIs型限制性内切核酸酶切割所述第一、第二和第三多核苷酸并连接所得切割产物的条件下接触，从而产生编码所述目标多肽的融合多核苷酸。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述融合多核苷酸在5'至3'方向上包含：
(aa)编码所述目标多肽的第一部分的核酸序列，
(bb)编码所述第一内含子的核酸序列，其中所述第一内含子是功能性的，并且其中所述第一内含子包含编码所述第一内含子的5'部分的核酸序列和编码所述第一内含子的3'部分的核酸序列，
(cc)编码所述目标多肽的第二部分的核酸序列，
(dd)编码所述第二内含子的核酸序列，其中所述第二内含子是功能性的，并且其中所述第二内含子包含编码所述第二内含子的5'部分的核酸序列和编码所述第二内含子的3'部分的核酸序列，以及
(ee)编码所述目标多肽的第三部分的核酸序列。


3.根据权利要求1和2所述的方法，其中所述融合多核苷酸当在真核宿主细胞中转录时被转录为在所述细胞中进行加工的转录物，使得每个内含子被从所述转录物剪接出来，从而产生编码所述目标多肽的mRNA。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述第一内含子和/或所述第二内含子对于所述融合多核苷酸是异源的。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中编码所述第一内含子的多核苷酸和/或编码所述第二内含子的多核苷酸具有40至2000bp的长度。


6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中编码所述第一和/或第二内含子的多核苷酸具有50至200bp，特别地50至150bp的长度。


7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述第一和/或第二内含子包含与编码所述目标多肽的融合多核苷酸的开放阅读框同框的内部终止密码子。


8.一种产生目标多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)通过根据权利要求1至7中任一项所述的方法产生编码所述目标多肽的融合多核苷酸，和
(ii)在真核宿主细胞中表达所述融合多核苷酸，从而产生所述目标多肽，以及任选地
(iii)从所述真核宿主细胞分离所产生的目标多肽。


9.一种组合物，所述组合物包...

【专利技术属性】
技术研发人员：W·鲁施纳，W·迪特里奇，J·比肯菲尔德，M·施耐德，
申请(专利权)人：赛诺菲，
类型：发明
国别省市：法国;FR