【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】GRAMC：顺式调节模块的基因组规模报道子测定方法相关申请的交叉参考本申请要求于2018年10月31日提交的美国临时申请号62/753,608的权益，其全部内容并入本文作参考。专利
本申请提供了报道子核酸的文库，例如功能性调节元件，以及用于构建和使用这种文库的方法和试剂盒。专利技术背景顺式调节模块(CRM)，如增强子、启动子和阻抑物是基因组中的功能元件。据估计，有几十万的CRM散布于人基因组中(Niu,etal.Nucleicacidsresearch46.11(2018):5395-5409；Visel,etal.Nature461.7261(2009):199；ENCODEProjectConsortium.Nature489.7414(2012):57)。由于CRM调节基因表达的时间、地点和水平，因此CRM几乎参与了每个生物过程。各个CRM直接与多种转录因子相互作用，多种CRM组合起作用以介导基因调节活性(Davidson.TheRegulatoryGenome,Elsevier(2006)；Levine,etal.Cell157.1(2014):13-25；DeLaat,etal.Nature502.7472(2013):499)。对这些元件进行综合实验鉴别是一个挑战。鉴别CRM的标准报道子测定是在基础启动子和报道基因上游克隆候选CRM，及检验其驱动报道基因表达的能力(Rosenthal,Methodsinenzymology152(1987):704-720；Arnone,eta...
【技术保护点】
1.一种构建核酸分子报道子文库的方法，包括：/n分离选定大小范围的多个核酸分子；/n使用连接酶将选定大小范围的多个分离的核酸分子连接至至少一个线性衔接子序列，其中所述线性衔接子序列包含至少两个连续核糖核苷酸，两侧是在3’末端的至少一个脱氧核糖核苷酸及在5’末端的至少一个脱氧核糖核苷酸，从而产生多个包含插入物和衔接子的环状核酸分子；/n在足以从所述多个环状核酸分子中去除线性核酸分子的条件下，使包含插入物和衔接子的多个环状核酸分子与核酸外切酶接触；/n在足以产生多个线性核酸分子的条件下使包含插入物和衔接子的多个环状核酸分子与核糖核酸内切酶接触，所述线性核酸分子均在插入物两侧包含在3’末端的至少一个脱氧核糖核苷酸以及在5’末端的至少一个脱氧核糖核苷酸；及/n将所述多个线性核酸分子的每一个与至少一个报道子核酸融合，以产生多个报道子构建体，从而产生核酸分子报道子文库。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181031 US 62/753,6081.一种构建核酸分子报道子文库的方法，包括：
分离选定大小范围的多个核酸分子；
使用连接酶将选定大小范围的多个分离的核酸分子连接至至少一个线性衔接子序列，其中所述线性衔接子序列包含至少两个连续核糖核苷酸，两侧是在3’末端的至少一个脱氧核糖核苷酸及在5’末端的至少一个脱氧核糖核苷酸，从而产生多个包含插入物和衔接子的环状核酸分子；
在足以从所述多个环状核酸分子中去除线性核酸分子的条件下，使包含插入物和衔接子的多个环状核酸分子与核酸外切酶接触；
在足以产生多个线性核酸分子的条件下使包含插入物和衔接子的多个环状核酸分子与核糖核酸内切酶接触，所述线性核酸分子均在插入物两侧包含在3’末端的至少一个脱氧核糖核苷酸以及在5’末端的至少一个脱氧核糖核苷酸；及
将所述多个线性核酸分子的每一个与至少一个报道子核酸融合，以产生多个报道子构建体，从而产生核酸分子报道子文库。
2.权利要求1的方法，其中所述连接酶包括DNA连接酶。
3.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述连接酶包括T4DNA连接酶。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中选定大小范围的多个核酸分子的长度为约100-3000个碱基对。
5.权利要求4的方法，其中选定大小范围的多个核酸分子的长度为约750-850个碱基对。
6.权利要求1-5任一项的方法，其中选定大小范围的多个分离的核酸分子使用凝胶电泳或基于珠的大小选择来选择。
7.权利要求1-6任一项的方法，其中选定大小范围的多个核酸分子包括基因组DNA或合成DNA。
8.权利要求7的方法，其中基因组DNA来自哺乳动物细胞、植物细胞、细菌细胞、真菌细胞或古细菌细胞。
9.权利要求8的方法，其中基因组DNA来自哺乳动物细胞。
10.权利要求8的方法，其中来自哺乳动物细胞的基因组DNA来自心肌细胞、神经元、肝细胞、内皮细胞、胚胎干细胞、皮肤细胞、癌细胞、肾细胞、免疫细胞、骨细胞、类器官衍生的细胞或诱导的干细胞中的至少一种。
11.权利要求8的方法，其中基因组DNA来自植物细胞。
12.权利要求8的方法，其中基因组DNA来自细菌细胞。
13.权利要求8的方法，其中基因组DNA来自真菌细胞。
14.权利要求8的方法，其中基因组DNA来自古细菌细胞。
15.权利要求1-14任一项的方法，其中使包含插入物和衔接子的多个环状核酸分子与核糖核酸内切酶接触包括使所述包含插入物和衔接子的多个环状核酸分子与特异于DNA双链体中的核糖核苷酸的核糖核酸内切酶接触。
16.权利要求15的方法，其中所述核糖核酸内切酶是RNaseHII或尿嘧啶-DNA糖基化酶。
17.权利要求1-16任一项的方法，其进一步包括确定多个线性核酸分子的基因组覆盖，所述线性核酸分子在插入物两侧包含所述在3’末端的至少一个脱氧核糖核苷酸以及所述在5’末端的至少一个脱氧核糖核苷酸。
18.权利要求17的方法，其中确定基因组覆盖包括：
选择至少一个感兴趣的基因组区域；
扩增所述多个线性核酸分子，其在插入物两侧包含所述在3’末端的至少一个脱氧核糖核苷酸和所述在5’末端的至少一个脱氧核糖核苷酸；及
确定在所述多个线性核酸分子中是否存在选择的基因组区域。
19.权利要求1-18任一项的方法，其中所述至少一个报道子核酸包含编码荧光蛋白的核酸和/或包含条形码核酸。
20.权利要求1-19任一项的方法，其进一步包括将所述多个线性核酸分子与线性载体核酸融合，从而产生多个线性载体，所述线性核酸分子在插入物两侧包含所述在3’末端的至少一个脱氧核糖核苷酸和所述在5’末端的至少一个脱氧核糖核苷酸。
21.权利要求20的方法，其中所述线性载体核酸包含基础启动子。
22.权利要求20或权利要求21的方法，其中：
所述至少一个报道子核酸包含编码荧光蛋白的核酸，以及在插入物两侧包含所述在3’末端的至少一个脱氧核糖核苷酸和所述在5’末端的至少一个脱氧核糖核苷酸的所述多个线性核酸分子与至少一个报道子核酸的融合包括将所述多个线性载体与荧光报道子核酸融合，从而产生多个荧光报道子构建体；或者
所述至少一个报道子核酸包括条形码核酸，以及在插入物两侧包含所述在3’末端的至少一个脱氧核糖核苷酸及所述在5’末端的至少一个脱氧核糖核苷酸的所述多个线性核酸分子与至少一个报道子核酸的融合包括将所述多个报道子线性载体与条形码核酸融合，从而产生多个条形码报道子构建体；或者
所述至少一个报道子核酸包含条形码核酸和编码荧光蛋白的核酸，及所述多个线性载体与至少一个报道子核酸的融合包括将所述多个报道子构建体与条形码核酸和编码荧光蛋白的核酸融合，从而产生多个荧光和条形码报道子构建体。
23.权利要求20-22任一项的方法，进一步包括：
使所述多个线性载体的每一个与包含条形码报道子构建体的引物核酸接触；
进行聚合酶链反应(PCR)，从而产生多个包含所述条形码报道子构建体的扩增的载体；
连接包含所述条形码报道子构建体的扩增的载体，从而产生多个包含所述条形码报道子构建体的环状载体；及
在足以从包含所述条形码报道子构建体的多个环状载体中去除线性核酸分子的条件下，使包含所述条形码报道子构建体的多个环状载体与核酸外切酶接触。
24.一种构建核酸分子报道子文库的方法，包括：
(i)分离选定大小范围的多个核酸分子；
使用连接酶将选定大小范围的多个分离的核酸分子与至少一个线性衔接子序列连接，其中所述线性衔接子序列包含至少两个连续核糖核苷酸，两侧是在3’末端的至少一个脱氧核糖核苷酸和在5’末端的至少一个脱氧核糖核苷酸，从而产生多个包含插入物和衔接子的环状核酸分子；
(ii)在足以从所述多个环状核酸分子中去除线性核酸分子的条件下，使包含插入物和衔接子的多个环状核酸分子与核酸外切酶接触；
(iii)在足以产生多个线性核酸分子的条件下，使包含插入物和衔接子的多个...
【专利技术属性】
技术研发人员：J·南，
申请(专利权)人：罗格斯新泽西州立大学，
类型：发明
国别省市：美国;US
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