一种sgRNA文库构建方法技术

本发明专利技术公开了一种sgRNA文库构建方法，包括以下步骤：第一步、sgRNA设计；第二步、上下游引物合成；第三步、构建sgRNA文库；所述的sgRNA由PCR扩增得到，涉及n条特异性引物Fn1，Fn2，Fn3，—Fnn，一条通用引物R；其中，特异性引物Fn1与载体5’端有20‑50bp同源，通用引物R与载体3’端有20‑50bp同源，且二者之间有15‑50bp的同源，与传统的退火连接方法相比，本发明专利技术通过PCR的方法得到混合sgRNA库，大大节省引物合成成本，提高合成产量。本发明专利技术提供了一种高通量、高效率的sgRNA基因文库构建方法。

【技术实现步骤摘要】
一种sgRNA文库构建方法
本专利技术属于基因工程领域，具体的，涉及一种sgRNA文库构建方法。
技术介绍
基于CRISPR-Cas系统的靶向基因组编辑技术是研究生物学和基因治疗的强大工具，能够完成RNA导向的靶基因识别及编辑(敲除、插入、突变)。CRISPR-Cas系统最初发现于细菌体内，CRISPR(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)与Cas蛋白一起实现针对外源基因的免疫防御。CRISPR是细菌内一段小段规律成簇间隔短回文序列，CRISPR-Cas9基因编辑系统主要由Cas9和sgRNA组成，Cas9是与CRISPR序列相关的核酸内切酶，sgRNA为一段序列特异性向导RNA分子(sequence-specificguideRNA)，可引导Cas9到达靶基因处，从而完成基因组的编辑。除了多克隆筛选方法外，CRISPR-Cas可用于快速高效地生成大量的敲除细胞，针对全基因组sgRNA的基因文库做大规模的功能基因筛选，如利用人源细胞的慢病毒敲除sgRNA文库，筛选出疽本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种sgRNA文库构建方法，其特征在于，包括以下步骤：/n第一步、sgRNA设计；/n第二步、上下游引物合成；/n第三步、构建sgRNA文库。/n

【技术特征摘要】
1.一种sgRNA文库构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步、sgRNA设计；
第二步、上下游引物合成；
第三步、构建sgRNA文库。


2.根据权利要求1所述的一种sgRNA文库构建方法，其特征在于，sgRNA设计具体操作为针对需编辑的基因设计sgRNA，每个基因通常设计3条sgRNA，每条sgRNA20bp，20个碱基作为靶基因的特异性识别序列。


3.根据权利要求1所述的一种sgRNA文库构建方法，其特征在于，上下游引物合成具体步骤为上游引物50-80bp，从5’端至3’端依次为与载体的5’端20-40bp同源序列，20bpsgRNA，15-20b与下游引物3’端互补序列；下游引物为通用引物，35-60bp，从5’端至3’端依次为与载体的5’端20-40bp同源序列，15-20b与上游引物3’端互补序列。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：喻明军，崔康乐，王维坤，骆晓雯，纪世春，
申请(专利权)人：通用生物系统安徽有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34