一种提高文库转化率的二代测序建库试剂盒及其方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域的方法及试剂盒，具体而言，具体为一种提高文库转化率的二代测序建库试剂盒及其方法，特别适用于微量样本的二代测序应用；所述试剂盒包括：酶混液，包括第一酶混液、第二酶液和第三酶混液；所述第一酶混液由T4多聚核苷酸激酶、T4DNA聚合酶、Klenow片段和Taq酶按照3:1:2:1的比例混合而成；所述第二酶液为T4 DNA连接酶；所述第三酶混液为2X QuarTaq HiFi HotStart混合液；缓冲液，所述缓冲液包括第一酶混液所对应的第一缓冲液和所述第二酶液所对应的第二缓冲液，所述第二缓冲液由浓度为0.1‑0.6M的Tris‑HCl、浓度为0.05‑0.1M的MgCl2、浓度为0.01‑0.05M的DTT、浓度为1‑10mM的ATP、浓度为30％‑50％的PEG6000和浓度为10‑20％的1,2丙二醇混合而成；接头、index序列和通用引物。

【技术实现步骤摘要】
一种提高文库转化率的二代测序建库试剂盒及其方法
本专利技术涉及生物
的方法及试剂盒，具体而言，具体为一种提高文库转化率的二代测序建库试剂盒及其方法。
技术介绍
高通量测序技术，在有些文献中称其为下一代测序技术(NextgenerationSequencing，NGS)，是对传统测序(Sanger测序)一次划时代的革命性的改变，一次测序可对几十万到几百万条DNA分子序列进行测定。近几年来，包括人、拟南芥以及水稻等越来越多的基因组被测序，全基因组测序为重要基因的克隆、基因的系统进化和基因组学研究提供了坚实的平台。但依然有部分珍贵物种由于样本较少获取难度大，或者个体较小获得的基因组浓度较低等原因，得到的基因组DNA少(低于50ng)。ctDNA由于携带了肿瘤细胞的全部变异信息，且这些基因突变仅存在于癌前细胞或癌细胞基因组中，不会在同一机体的其他正常细胞DNA中出现，相对于传统的组织学样本能够更好的体现肿瘤异质性。此外，ctDNA无需侵入性取材，只需取一管血即可检测，能够方便地监测肿瘤进程、监测靶向治疗动态。因此，基于ctDNA的肿瘤基因检测技术逐渐成为临床应用的热点，具有广泛前景。虽然ctDNA检测技术具有很大潜力，但血液中游离DNA含量很少，平均1ml血浆中只能提取到约10ng左右总游离DNA，按照每个单体型基因组DNA为3.3pg计算。一共只有3000个左右的基因组分子。而肿瘤的ctDNA占总游离DNA比例较低，一般只有0.1％-10％。对于这些微量DNA样本，高建库转化效率是提高测序检测中对低频变异分析效率的关键参数之一。文库转化率也就是原始DNA分子数与两端连上接头的分子数比例。这也是建库试剂盒最核心的性能表现。对于后续靶向捕获或生物信息分析都是非常重要的。更高的文库转化率带来更高的库容，也就是文库分子多样性，无论对于提高样本检测的灵敏度还是配合分子标签法提高检测的特异性都是首要条件。针对微量DNA样本(＜50ng)，目前常用的国内外商品化的建库试剂盒的建库转化效率偏低，如其中行业口碑很好，也是应用最广泛的罗氏KAPABiosystems的KAPAHyper系列建库试剂盒官方说明书上文库转化率为5-40％，还不能满足很多应用场景。因此，仍需要对现有技术进行改进，以改善现有的微量起始样本建库转化率较低的缺陷。
技术实现思路
针对
技术介绍
中提到的问题，本专利技术提供一种提高文库转化率的二代测序建库试剂盒及其方法，特别适用于微量样本的二代测序应用。本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种提高文库转化率的二代测序建库试剂盒，所述试剂盒包括：(1)酶混液，包括第一酶混液、第二酶液和第三酶混液；所述第一酶混液由T4多聚核苷酸激酶、T4DNA聚合酶、Klenow片段和Taq酶按照3:1:2:1的比例混合而成；所述第二酶液为T4DNA连接酶；所述第三酶混液为2XQuarTaqHiFiHotStart混合液；(2)缓冲液，所述缓冲液包括第一酶混液所对应的第一缓冲液和所述第二酶液所对应的第二缓冲液，所述第一缓冲液由浓度为0.1-0.6M的Tris-HCl发卡型接头、浓度为0.05-0.1M的MgCl2、浓度为0.01-0.05M的DTT、浓度为0.1-1mM的dNTP和浓度为1-10mM的dATP混合而成；所述第二缓冲液由浓度为0.1-0.6M的Tris-HCl、浓度为0.05-0.1M的MgCl2、浓度为0.01-0.05M的DTT、浓度为1-10mM的ATP、浓度为30％-50％的PEG6000和浓度为10-20％的1,2丙二醇混合而成；(3)接头、index序列和通用引物。作为优选，所述第一酶混液中T4多聚核苷酸激酶的工作浓度为0.05～0.2U/μL，所述T4DNA聚合酶的工作浓度为0.01～0.1U/μL，所述Klenow片段的工作浓度为0.01～0.05U/μL，所述Taq酶的工作浓度为0.01-0.05U/μL。作为优选，所述第一缓冲液中Tris-HCl的工作浓度为40～100mM，所述MgCl2的工作浓度为5～20mM，所述DTT的工作浓度为1～10mM，所述dNTP混合液的工作浓度为0.04～0.12mM，所述dATP的工作浓度为0.2-1.0mM。作为优选，所述第二缓冲液中，所述Tris-HCl的工作浓度为10～40mM，所述MgCl2的工作浓度为1～5mM，所述DTT的工作浓度为1～3mM，所述ATP的工作浓度为0.5～1.5mM，所述PEG6000的工作浓度为5％-10％w/v，所述1,2丙二醇的工作浓度为1％-4％v/v。作为优选，所述T4DNA连接酶的工作浓度为10～50U/μL；所述2XQuarTaqHiFiHotStart混合液的工作浓度为1X。作为优选，所述接头为发卡型接头，由接头序列自身退火形成具有一个粘末端的茎环结构。作为优选，所述接头序列为序列表的序列1所示；所述的index序列如序列表的序列2所示；所述通用引物序列为序列表的序列3所示。本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种提高文库转化率的的方法，包括如下步骤：对样本的基因组DNA进行片段化，得到DNA片段；利用第一酶混液和第一缓冲液对DNA片段进行末端修复及加A，得到修复片段；在DNA片段进行末端修复及加A过程中，利用同样具有dATP偏爱性DNA末端非模板依赖性加A活性的Taq酶完成DNA末端的加A；在接头连接中添加具有连接增强作用的小分子物质；在末端修复及加A步骤中，将DNA片段与上述的末端修复与加A缓冲液和末端修复与加A酶混合后，于20℃-37℃孵育15-30分钟，37℃-65℃孵育15-30分钟；利用第二酶液、第二缓冲液以及接头对所述修复片段进行接头连接，得到带接头片段；利用第三酶混液和index序列、通用引物对所述带接头片段进行PCR富集，得到所述DNA文库。作为优选，在得到所述带接头片段的步骤后，以及在对所述带接头片段进行PCR富集之后，所述方法还包括进行磁珠纯化的步骤。作为优选，所述连接增强剂可以为PEG6000或1,2丙二醇。综上所述，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术的提高文库转化率的二代测序建库试剂盒及其方法将通过调整缓冲液配方将DNA末端修复/加A一步完成，减少纯化导致的DNA损失，提高了DNA文库制备的效率。同时整体所需时间从2个半小时左右减少到1个半小时左右，且省去的DNA纯化步骤减少了试剂耗材消费，节约了成本，降低了制备DNA文库所需的最低DNA质量；本专利技术方法采用特殊的茎环型接头，由接头序列自身退火形成具有一个粘末端的茎环结构，另一段封闭，不包含类似Y接头的两个游离末端，降低接头连接过程的空间位阻和自我连接，比传统的Y型接头显著提高连接步骤效率，进而贡献了高的文库转化率。本专利技术方法在上述接头连接的步骤中通过添加具有连接增强作用的小分子物质，利用这些小分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高文库转化率的二代测序建库试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：/n(1)酶混液，包括第一酶混液、第二酶液和第三酶混液；/n所述第一酶混液由T4多聚核苷酸激酶、T4 DNA聚合酶、Klenow片段和Taq酶按照3:1:2:1的比例混合而成；/n所述第二酶液为T4 DNA连接酶；/n所述第三酶混液为2X QuarTaq HiFi HotStart混合液；/n(2)缓冲液，所述缓冲液包括第一酶混液所对应的第一缓冲液和所述第二酶液所对应的第二缓冲液，/n所述第一缓冲液由浓度为0.1-0.6M的Tris-HCl发卡型接头、浓度为0.05-0.1M的MgCl2、浓度为0.01-0.05M的DTT、浓度为0.1-1mM的dNTP和浓度为1-10mM的dATP混合而成；/n所述第二缓冲液由浓度为0.1-0.6M的Tris-HCl、浓度为0.05-0.1M的MgCl2、浓度为0.01-0.05M的DTT、浓度为1-10mM的ATP、浓度为30％-50％的PEG6000和浓度为10-20％的1,2丙二醇混合而成；/n(3)接头、index序列和通用引物。/n

【技术特征摘要】
1.一种提高文库转化率的二代测序建库试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
(1)酶混液，包括第一酶混液、第二酶液和第三酶混液；
所述第一酶混液由T4多聚核苷酸激酶、T4DNA聚合酶、Klenow片段和Taq酶按照3:1:2:1的比例混合而成；
所述第二酶液为T4DNA连接酶；
所述第三酶混液为2XQuarTaqHiFiHotStart混合液；
(2)缓冲液，所述缓冲液包括第一酶混液所对应的第一缓冲液和所述第二酶液所对应的第二缓冲液，
所述第一缓冲液由浓度为0.1-0.6M的Tris-HCl发卡型接头、浓度为0.05-0.1M的MgCl2、浓度为0.01-0.05M的DTT、浓度为0.1-1mM的dNTP和浓度为1-10mM的dATP混合而成；
所述第二缓冲液由浓度为0.1-0.6M的Tris-HCl、浓度为0.05-0.1M的MgCl2、浓度为0.01-0.05M的DTT、浓度为1-10mM的ATP、浓度为30％-50％的PEG6000和浓度为10-20％的1,2丙二醇混合而成；
(3)接头、index序列和通用引物。


2.根据权利要求1所述的提高文库转化率的二代测序建库试剂盒，其特征在于，所述第一酶混液中T4多聚核苷酸激酶的工作浓度为0.05～0.2U/μL，所述T4DNA聚合酶的工作浓度为0.01～0.1U/μL，所述Klenow片段的工作浓度为0.01～0.05U/μL，所述Taq酶的工作浓度为0.01-0.05U/μL。


3.根据权利要求1所述的提高文库转化率的二代测序建库试剂盒，其特征在于，所述第一缓冲液中Tris-HCl的工作浓度为40～100mM，所述MgCl2的工作浓度为5～20mM，所述DTT的工作浓度为1～10mM，所述dNTP混合液的工作浓度为0.04～0.12mM，所述dATP的工作浓度为0.2-1.0mM。


4.根据权利要求1所述的提高文库转化率的二代测序建库试剂盒，其特征在于，所述第二缓冲液中，所述Tris-HCl的工作浓度为10～40mM，所述MgCl2的工作浓度为...

【专利技术属性】
技术研发人员：张满仓，曾志鹏，
申请(专利权)人：上海迪赢生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31