用于纳米孔测序的单细胞或微量样本全长转录组文库构建方法技术

本发明专利技术涉及单细胞测序技术领域，具体涉及用于纳米孔测序的单细胞或微量样本全长转录组文库构建方法。本发明专利技术提供的文库构建方法包括：将单细胞或微量样本裂解后，采用Smart‑seq2方法将mRNA反转录制备cDNA，以所述cDNA为模板进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行FFPE和末端修复，再连接纳米孔测序接头。该方法可以实现真正的单细胞测序，且兼具转录本覆盖度高、分辨率高、灵活性强的优点，可应用于单细胞的差异基因表达分析、转录本结构分析、全长isoform鉴定等。

【技术实现步骤摘要】
用于纳米孔测序的单细胞或微量样本全长转录组文库构建方法
本专利技术涉及单细胞测序
，具体涉及用于纳米孔测序的单细胞或微量样本全长转录组文库构建方法。
技术介绍
对于多细胞生物来讲，尽管来自于一个受精卵，但随着个体的发育，细胞逐渐分化成不同的亚群，它们各自表达不同的遗传信息，行使不同的生理功能。对于同一个组织，相邻的细胞之间也存在异质性，比如脑组织、心脏组织。特别的，肿瘤是一个突变细胞的集合，笼统地对肿瘤组织和微环境细胞进行基因分析(bulkphasesequencing)，不同细胞的混合测序很可能掩盖某些关键的信息。而单细胞测序可以完美解决这个问题，极大地提高了测序分析的分辨率，使得遗传信息精确到单细胞水平，为个体发育与疾病研究等提供了强有力的帮助。近年来，单细胞测序技术正引领新一轮生物医学领域的技术革命。目前商业化的单细胞处理平台包括FluidigmC1,10Xgenomics等技术，这些方法优势在于高通量，而目前的实验流程仅限于对转录本3’端进行测序分析。因此忽略了转录本整体的信息。SMART-seq是一项里程碑意义的技术，能够覆盖完整的转录本，从而在表达分析的基础上，进一步实现可变剪切和SNV检测等深入研究。纳米孔(Nanopore)平台是新兴的实时单分子纳米孔测序技术平台：借助单个分子通过纳米孔时引起孔两侧电位差来实现信号检测，纳米孔的直径仅允许单个核苷酸聚合物通过，而A、T、C、G四种碱基的带电性质不同，因此通过电信号差异特征即可检测出通过纳米孔的碱基类型，从而实现测序。纳米孔测序的读长更长，平均读长可达20kb，最大可达到Mb级别，而且在测序过程中不具有由PCR反应引起的GC偏好性，覆盖更均匀。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于纳米孔测序的单细胞或微量样本全长转录组文库构建方法。为实现上述目的，本专利技术将SMART技术和ONT纳米孔测序技术相结合，开发单细胞/微量样本全长转录组文库构建方法，该方法利用SMART技术获得单细胞/微量样本的全长转录组，再连接纳米孔测序接头得到待测序的文库样本，该文库样本可用于纳米孔三代测序。具体地，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供用于纳米孔测序的单细胞或微量样本全长转录组文库构建方法，该方法包括：将单细胞或微量样本裂解后，采用Smart-seq2方法将mRNA反转录制备cDNA，以所述cDNA为模板进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行FFPE和末端修复，再连接纳米孔测序接头。具体地，对细胞分选或者纤维切割等方法获取的单细胞样本或微量RNA样本进行单管内裂解，后续操作可在一管内进行。在单细胞或微量样本的裂解后，以Smart-seq2的反转录引物进行cDNA的合成，并且利用反转录酶的模板转换(Template-switching)活性在cDNA的5’端添加一段接头序列，然后利用链转换引物与之结合延伸，进行PCR扩增合成双链cDNA，获得全长转录本序列，对所述双链cDNA进行FFPE修复和末端修复，并加上A，然后通过TA连接的方法加上由ONT的测序接头，再利用nanopore测序技术实现全长转录本的端到端的测序。本专利技术发现，采用SMART技术获得的全长转录组与ONT接头的连接效率较低，较难满足nanopore测序的高效性要求。为提高采用SMART技术获得的全长转录组与ONT接头连接的效率，本专利技术对影响接头连接效率的因素进行了筛选和优化，并发现，通过同时控制FFPE和末端修复的反应条件和纳米孔测序接头连接的反应条件能够显著提高SMART技术获得的全长转录组与ONT接头连接的效率。优选地，所述FFPE和末端修复的反应条件为：将反应体系于20℃反应30-35min；再于65℃反应10min；或者，先在PCR纯化产物中加入FFPEMasterMix和FFPEbuffer，于20℃反应10-15min，再加入EndprepMasterMix、Endprepbuffer和水，于20℃反应30-35min，再于65℃反应10min；所述连接纳米孔测序接头的反应条件为：22-25℃反应1h-1.5h。本专利技术发现，将FFPE和末端修复的反应条件和连接纳米孔测序接头的反应条件同时控制在上述条件，可显著提高SMART技术获得的全长转录组与ONT接头连接的效率，进而提高后续ONT测序的效率。优选地，所述FFPE和末端修复的60μL反应体系包括如下组分：PCR纯化产物200ng-1500ng，FFPEbuffer3.5μL，FFPEMasterMix2μL，Endprepbuffer3.5μL，EndprepMasterMix2-3μL，水补足至总体积60μL。进一步地，本专利技术还发现，与ONT推荐的其它测序接头相比，AMX测序接头能够更好地匹配于SMART技术获得的全长转录组，提高接头连接效率和ONT测序效率。基于此，所述纳米孔测序接头优选为ONTAdapterMix(AMX)测序接头。进一步优选地，所述连接纳米孔测序接头的60μL反应体系包括如下组分：FFPE和末端修复纯化产物100-1300ng，ONTAdapterMix(AMX)测序接头5μL，ONTLNB25μL，T4DNA连接酶10μL，水补足至总体积60μL。以上所述的文库构建方法中，利用Smart-seq2方法进行反转录优选包括如下步骤：先将mRNA、反应缓冲液和水混合后置于低温，再与3’SMART-SeqCDSPrimerIIA混合后于72℃处理2-3min，得到第一预混液；将5×UltraLowFirst-StrandBuffer、SMART-Seqv4Oligonucleotide和RNA酶抑制剂混合后再与SMARTScribe反转录酶混合得到第二预混液；将第一预混液与第二预混液混合进行反转录反应。优选地，所述反转录反应的条件为：42℃，85-95min；70℃，8-12min。更优选为42℃，90min；70℃，10min。上述反转录反应中，反转录引物通过退火与mRNA的polyA尾结合，该反转录引物是经过修饰的OligodT引物，可与任何polyARNA杂交，在引物位点加尾以进行后续扩增；然后加入RT逆转录酶合成第一链(该RT逆转录酶的特性是在反转录至mRNA模板末端时自动加三个C碱基)，链转换引物与之结合，逆转录酶继续延伸，得到与链转换引物互补的序列。在上述反转录反应后，通过PCR扩增合成双链cDNA，该cDNA即为全长转录本。以上所述的文库构建方法中，所述PCR扩增的反应条件为：95℃，1-1.5min；98℃，10-15sec，65℃，25-35sec，68℃，3-4min，15-20个循环；72℃，8-12min。优选为：95℃，1min；98℃，10sec，65℃，30sec，68℃，3min，15-20个循环；72℃，10min。优选地，所述PCR扩增的30μL反应体系包括如下组分：2×SeqAmpPCRBuffer(或者2×SeqAmpCBPCRB本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于纳米孔测序的单细胞或微量样本全长转录组文库构建方法，其特征在于，包括：将单细胞或微量样本裂解后，采用Smart-seq2方法将mRNA反转录制备cDNA，以所述cDNA为模板进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行FFPE和末端修复，再连接纳米孔测序接头。/n

【技术特征摘要】
1.用于纳米孔测序的单细胞或微量样本全长转录组文库构建方法，其特征在于，包括：将单细胞或微量样本裂解后，采用Smart-seq2方法将mRNA反转录制备cDNA，以所述cDNA为模板进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行FFPE和末端修复，再连接纳米孔测序接头。


2.根据权利要求1所述的用于纳米孔测序的单细胞或微量样本全长转录组文库构建方法，其特征在于，所述FFPE和末端修复的反应条件为：将反应体系于20℃反应30-35min，再于65℃反应10min，或者，先在PCR纯化产物中加入FFPEMasterMix和FFPEbuffer，于20℃反应10-15min，再加入EndprepMasterMix、Endprepbuffer和水，于20℃反应30-35min，再于65℃反应10min；
所述连接纳米孔测序接头的反应条件为：22-25℃反应1-1.5h。


3.根据权利要求1或2所述的用于纳米孔测序的单细胞或微量样本全长转录组文库构建方法，其特征在于，所述FFPE和末端修复的60μL反应体系包括如下组分：PCR纯化产物200-1500ng，FFPEbuffer3.5μL，FFPEMasterMix2μL，Endprepbuffer3.5μL，EndprepMasterMix2-3μL，水补足至总体积60μL。


4.根据权利要求1～3任一项所述的用于纳米孔测序的单细胞或微量样本全长转录组文库构建方法，其特征在于，所述纳米孔测序接头为ONTAdapterMix。


5.根据权利要求4所述的用于纳米孔测序的单细胞或微量样本全长转录组文库构建方法，其特征在于，所述连接纳米孔测序接头的60μL反应体系包括如下组分：FFPE和末端修...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑洪坤，刘敏，陈钰萌，张梦龙，
申请(专利权)人：北京百迈客生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11