CAR-T细胞、其构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种CAR‑T细胞、其构建方法及其应用。该CAR‑T细胞是一种重组脐带血来源的T细胞，其不含有脐带血来源的T细胞的CD7基因和TRAC基因，所述CAR‑T细胞表达CAR，所述CAR特异性靶向于CD7。该CAR‑T细胞在体外和体内有效杀死人T‑ALL细胞系而不会导致移植物抗宿主病。

【技术实现步骤摘要】
CAR-T细胞、其构建方法及其应用
本申请属于生物
，具体涉及一种CAR-T细胞、其构建方法及其应用。
技术介绍
T细胞恶性肿瘤是一种破坏性极强的血液恶性肿瘤，在儿童和成人中具有很高的复发率和死亡率，目前尚无有效的治疗方法。目前，对于T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)的治疗策略主要包括强化化疗，异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)，抗病毒治疗和分子靶向治疗。但是，强化化疗通常不能阻止疾病治疗后的复发。对于那些在初次治疗后复发的患者，补救性化疗方案的缓解率大约只有20-40％。另外，虽然造血干细胞移植可能是目前唯一可以治愈的方案，但是也会伴有移植物抗宿主病带来的风险。近年来，嵌合抗原受体T细胞(chimericantigenreceptorTcells，CAR-T细胞)免疫疗法在B细胞恶性肿瘤中具有显著的临床效果。CAR-T细胞治疗技术是使用转基因技术在T细胞表面表达CAR，赋予T细胞靶向识别肿瘤细胞和杀伤肿瘤细胞的功能，再把改造过的T细胞回输给患者，从而达到控制甚至清除肿瘤的一种免疫治疗技术。一般而言，嵌合抗原受体包含胞外抗原结合域，跨膜域和胞内信号转导域。胞外抗原结合域包含靶向肿瘤抗原的单链可变片段(scfv)。CD7是一种跨膜糖蛋白，其在T细胞和自然杀伤细胞(NK)上表达，而且在急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)、T细胞淋巴瘤中呈高表达，约30％急性髓细胞白血病(AML)患者的肿瘤细胞中，可检测到CD7抗原表达。CD7分子作为血液系统恶性疾病的肿瘤细胞表面的异常标志物，被用来做恶性T淋巴细胞白血病的免疫治疗抗体的靶点。基于CD19-CAR在B细胞恶性肿瘤中具有显著的临床效果，但是目前针对T细胞血液肿瘤还无上市的CAR-T产品，主要处在临床研究阶段。CD7-CART制备技术存在以下挑战：1.T细胞内源性的CD7会使CD7-CART细胞互相残杀；2.T细胞血液恶性肿瘤和正常T细胞可共表达许多相同表面抗原，从而使得非常难以将正常T细胞从含有恶性T细胞的T细胞中纯化出来以用于基因编辑和慢病毒转导。另外，如果纯化的过程不是完全的，则可能存在恶性T细胞污染群体。
技术实现思路
本专利技术提供了一种CAR-T细胞，所述CAR-T细胞是一种重组脐带血(UCB)来源的T细胞，所述CAR-T细胞不含有脐带血来源的T细胞的CD7基因和TRAC基因，所述CAR-T细胞表达CAR，所述CAR特异性靶向于CD7。可选地，根据上述的CAR-T细胞，所述CAR含有抗CD7的单链抗体。可选地，根据上述的CAR-T细胞，所述CAR由抗CD7的单链抗体、4-1BB、CD3ζ和tEGFR连接而成。可选地，根据上述的CAR-T细胞，所述CAR是氨基酸序列是序列表中SEQIDNo.2的蛋白质。可选地，根据上述的CAR-T细胞，所述CAR-T细胞按照下述的方法构建。本专利技术还提供了构建上述的CAR-T细胞的方法，所述方法包括：(1)将CAR基因导入脐带血来源的T细胞，获得重组细胞；(2)采用CRISPR/Cas9系统敲除所述重组细胞的CD7基因和TRAC基因，得到CD7基因和TRAC基因被敲除的重组细胞，所述CD7基因和TRAC基因被敲除的重组细胞为所述CAR-T细胞；所述CAR基因编码上述的CAR-T细胞中的CAR。可选地，根据上述的方法，所述CAR基因的编码链的编码序列是SEQIDNo.1中的第15位-2585位。可选地，根据上述的方法，所述CRISPR/Cas9系统包括特异性靶向于CD7基因的gRNA和特异性靶向于TRAC基因的gRNA，所述特异性靶向于CD7基因的gRNA的靶标核苷酸序列是5’-GGAGCAGGTGATGTTGACGG-3’，所述特异性靶向于TRAC基因的gRNA的靶标核苷酸序列是5’-GAGAATCAAAATCGGTGAAT-3’。可选地，所述特异性靶向于CD7基因的gRNA的序列如SEQIDNo.5所示。可选地，所述特异性靶向于TRAC基因的gRNA的序列如SEQIDNo.6所示。可选地，所述步骤(2)包括将Cas9蛋白和所述gRNA采用电穿孔法转染至所述脐带血来源的T细胞，所述电穿孔法转染的电压为300V，脉冲时间为1000ms，电脉冲转染次数1次。本专利技术还提供了一种抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物包括上述的CAR-T细胞。上述的CAR-T细胞或上述的方法在制备抗肿瘤药物中的应用也属于本专利技术的保护范围。所述肿瘤可为以CD7为靶点的恶性肿瘤，也可为T细胞恶性肿瘤，例如，所述肿瘤选自急性T淋巴细胞白血病、T细胞淋巴瘤、急性髓细胞白血病中的一种或多种。T细胞恶性肿瘤和正常T细胞可共表达许多相同表面抗原，从而使得非常难以将正常T细胞从含有恶性T细胞的T细胞中纯化出来用于CAR-T细胞的生产。本专利技术使用同种异体CAR-T细胞解决恶性细胞污染的风险。本专利技术采用UCB来源的T细胞制备通用型的CD7-CAR-T细胞，并使用CRISPR/Cas9基因编辑，同时敲除CD7基因和TRAC基因，制备出CD7和TRAC双敲除的CD7-CAR(UCAR7)T细胞。这些UCAR7T细胞在体外和体内有效杀死人T-ALL细胞系而不会导致移植物抗宿主病(GVHD)。附图说明图1A为实施例1的CD7-CAR基因的结构示意图。图1B为实施例1的CAR7T细胞和对照T细胞表面CD7的表达及CAR的表达流式图。图1C为实施例1的CAR7T细胞和对照T细胞扩增曲线图。图2A为实施例3的CD7-CAR7T细胞制备示意图。图2B为实施例3的CD7-CAR7T细胞和对照T细胞表面CD3的表达和CD7的表达流式图。图2C为实施例3的CD7-CAR7T细胞、CAR7T细胞和对照T细胞表面CAR的表达及CD7的表达流式图。图2D为实施例3的CD7-CAR7T细胞、CAR7T细胞和对照T细胞扩增曲线图。图2E为实施例3的CD7-CAR7T细胞、CAR7T细胞和对照T细胞在不同比例下对CCRF-CEM的杀伤效果检测。图2F为实施例3的CD7-CAR7T细胞、CAR7T细胞和对照T细胞的IFN-γ分泌的检测。图3A为实施例4的UCAR7T细胞制备示意图。图3B为实施例4的UCAR7T细胞和对照T细胞表面TCRαβ的表达及CD7表达流式图；对照T细胞和UCAR7T细胞表面CAR的表达及CD7表达流式图。图3C为实施例4UCAR7T细胞和对照T细胞的扩增曲线图。图3D为实施例4UCAR7T细胞和对照T细胞的IFN-γ及TNF-α分泌检测。图3E为实施例4UCAR7T细胞和对照T细胞的在不同比例下对CCRF-CEM的杀伤效果检测。图4A为实施例5动物试验的流程示意图。图4B为实施例5不同组小鼠的总生存情况。图4C为实施例5不同组小鼠的肿瘤生长情况。图5为实施例2的电转条件的优化流式图。...

【技术保护点】
1.CAR-T细胞，其特征在于：所述CAR-T细胞是一种重组脐带血来源的T细胞，所述CAR-T细胞不含有脐带血来源的T细胞的CD7基因和TRAC基因，所述CAR-T细胞表达CAR，所述CAR特异性靶向于CD7。/n

【技术特征摘要】
1.CAR-T细胞，其特征在于：所述CAR-T细胞是一种重组脐带血来源的T细胞，所述CAR-T细胞不含有脐带血来源的T细胞的CD7基因和TRAC基因，所述CAR-T细胞表达CAR，所述CAR特异性靶向于CD7。


2.根据权利要求1所述的CAR-T细胞，其特征在于：所述CAR含有抗CD7的单链抗体。


3.根据权利要求1所述的CAR-T细胞，其特征在于：所述CAR由抗CD7的单链抗体、4-1BB、CD3ζ和tEGFR连接而成。


4.根据权利要求1-3中任一所述的CAR-T细胞，其特征在于：所述CAR是氨基酸序列是序列表中SEQIDNo.2的蛋白质。


5.根据权利要求1-4中任一所述的CAR-T细胞，其特征在于：所述CAR-T细胞按照权利要求6-8中任一所述的方法构建。


6.构建权利要求1-4中任一所述的CAR-T细胞的方法，其特征在于：所述方法包括：
(1)将CAR基因导入脐带血来源的T细胞，获得重组细胞；
(2)采用CRISPR/Cas9系统敲除所述重组细胞的C...

【专利技术属性】
技术研发人员：李建强，刘莹，王琳，牛星，
申请(专利权)人：河北森朗生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：河北;13