一种无标记褪黑素膜受体MT1的细胞筛选模型及应用制造技术

本发明专利技术涉及无标记G蛋白偶联受体（GPCR）的细胞筛选模型构建方法及应用，具体地说是一种无标记褪黑素膜受体亚型MT1的细胞筛选模型。本发明专利技术基于无标记细胞整合药理学技术，利用MT1稳定表达的细胞系，建立了筛选MT1受体激动剂和拮抗剂的方法。此方法还可以用于研究影响MT1受体下游通路的调节剂。本发明专利技术构建的MT1细胞筛选模型不需要荧光标记且检测过程无需额外添加指示剂，具有靶点‑通路整合响应、对细胞无损伤、检测结果可靠、灵敏度高、筛选通量高及操作简便等特点。其用于从天然产物库、代谢产物库及组合化学库中寻找MT1受体的激动剂、拮抗剂和通路调节剂，及MT1受体参与的失眠、异常生理节律、情绪障碍及肿瘤相关疾病的药物筛选。

【技术实现步骤摘要】
一种无标记褪黑素膜受体MT1的细胞筛选模型及应用
本专利技术涉及无标记GPCR细胞筛选模型的构建方法，具体地说是一种无标记褪黑素膜受体MT1的细胞筛选模型及应用。
技术介绍
G蛋白偶联受体（G-protein-coupledreceptor,GPCR）是细胞信号传导中最重要的一类膜受体，也是小分子药物开发中最受关注的药物靶点之一，约34％的现代药物直接靶向该受体家族[Hauser,A.S.,etal.,NatureReviewsDrugDiscovery2017,16,829-842.]。褪黑素膜受体（MT1）属于GPCR家族的一员，于1994年首次从青蛙、羊和人克隆出MT1受体，由350个氨基酸组成[EbisawaT.,etal.,ProcNatlAcadSciUSA1994,91,6133–6137；ReppertSM.,etal.,Neuron1994,13,1177–1185.]。MT1受体在大脑，心血管系统（包括外周血管，主动脉和心脏），免疫系统，睾丸，卵巢，皮肤，肝脏，肾脏，肾上腺皮质，胎盘，乳腺，视网膜，胰腺和脾脏中均有表达[DubocovichML.,etal.,Endocrine2005,27,101–110；FischerTW.,etal.,ExpDermatol2008b,17,713–730；Pandi-PerumalSR.,etal.,ProgNeurobiol2008,85,335–353；SlominskiA.,etal.,Endocrine2005a,27,137–148；SlominskiA.,etal.,TrendsEndocrinolMetab2008,19,17–24.]。研究显示，MT1的激活能导致血管收缩[Pandi-PerumalSR.,etal.,ProgNeurobiol2008,85,335–353.]。此外，研究表明MT1受体基因除小鼠表型出异常行为，包括感觉运动门控受损和明显的抑郁情绪，提示MT1受体对正常的大脑和行为功能是非常重要的[WeilZM.,etal.,BrainResBull2006,68,425-429.]。此外，研究表明乳腺癌细胞中MT1受体的表达与褪黑素的抗肿瘤增殖作用呈正比，表明MT1受体参与调控乳腺癌的增殖过程[CollinsA.,etal.,CancerLett2003,189,49-57.]。构建MT1受体的细胞筛选模型，用以发现MT1受体的内源性配体、高活性激动剂、拮抗剂及通路调节剂，对揭示MT1的生物学功能及药理学特征具有重大意义。目前受体的高通量筛选方法主要有传统的放射性配体受体结合实验法、GTPγS结合实验法、环磷酸腺苷（cAMP）分析法、钙流检测法、报告基因检测法、受体的内吞检测法及β-arrestin的招募检测法等[Bylund,D.B.,etal.,AmericanJournalofPhysiology1993,265,L421-L429；Harrison,C.,etal.,LifeSciences2003,74,489-508；Zhang,R.,etal.,ActaPharmacologicaSinica2012,33,372-384；Emkey,R.,etal.,in:Janzen,W.P.,etal.(Eds.),HighThroughputScreening:MethodsandProtocol,SecondEdition；Fan,F.,etal.,AssayandDrugDevelopmentTechnologies2007,5,127-136；Zanella,F.,etal.,TrendsinBiotechnology2010,28,237-245；Luttrell,L.M.,etal.,JournalofCellScience2002,115,455-465.]。但这些方法都有一定的局限性，如传统的放射性配体受体结合实验法需要洗涤和过滤，实验周期长及通量低等不足，此技术也不能区分受体的激动剂和拮抗剂；其余的GPCR检测方法主要针对某条信号通路的激活，对多条通路的激活无法区别，需要荧光蛋白标记或者额外加入指示剂，操作繁琐，而且指示剂的加入对细胞也会产生一定的损伤，影响筛选结果的可靠性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种无标记褪黑素膜受体MT1的细胞筛选模型，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为了实现上述目的，借助于新型无标记细胞整合药理学技术，提供一种无标记褪黑素膜受体MT1的细胞筛选模型，以高通量筛选MT1受体内源性配体、激动剂、拮抗剂和通路调节剂，及MT1受体参与的失眠、异常生理节律、情绪障碍及肿瘤相关疾病的药物筛选应用。本专利技术的技术方案为：基于无标记细胞整合药理学技术，利用稳定表达MT1的细胞系CHO-MT1，借助于已知的激动剂和拮抗剂，建立MT1受体的细胞筛选模型。根据待测样品的DMR信号谱与已知激动剂和拮抗剂的DMR特征信号谱的相似性，判断待测样品的激动活性、拮抗活性，或者对下游通路的调节影响。所述的无标记细胞整合药理学技术为利用共振波导光栅（RWG）生物传感器将药物导致的细胞内成分的动态再分布现象转化为整体的、动态的波长位移响应信号，此信号为波长变化的响应值（pm），通过Epic光学生物传感器384微孔板实现。模型的建立过程为：1)在细胞兼容的具有光学生物传感功能的384微孔板中接种CHO-MT1细胞，接种的细胞密度为1.0~4.5×104个/孔，细胞培养液体积为40µL/孔，接种后细胞培养时间为18~24h。2)将溶解在HBSS缓冲盐中的MT1受体激动剂褪黑素以浓度为0.01~50000nM加入到接种CHO-MT1细胞的384微孔板中，检测其DMR特征信号谱；3)将溶解在HBSS缓冲盐中的MT1受体拮抗剂Luzindole以浓度为0.01~100000nM加入到接种CHO-MT1细胞的384微孔板中，检测其DMR特征信号谱；4)获得的所有DMR特征信号谱具有浓度-响应依赖关系且具有灵敏性、饱和性及特异性。其中，所述待测样品具有激动活性的筛选步骤如下：1)将溶解在HBSS缓冲盐中的MT1受体激动剂褪黑素以浓度为0.01~50000nM加入到接种CHO-MT1细胞的384微孔板中，检测其DMR特征信号谱；2)将待测样品以0.01nM~100µM加入到接种CHO-MT1细胞的微孔板中，检测其DMR信号谱；3)关联分析步骤1）和步骤2）中的DMR信号谱，若步骤2）的DMR信号谱与1）中的DMR特征谱具有轮廓相似性,则进行下一步骤；4)将MT1受体拮抗剂Luzindole以浓度0.01~100000nM加入到接种CHO-MT1细胞的微孔板中，预处理5~60min，加入与步骤2）中相同浓度的待测样品，检测其DMR信号，若此DMR信号强度低于步骤2）中的DMR信号强度，则判断此样品为MT1受体的激动剂。其中，所述待测样品具有拮抗活性的筛选步骤如下：1)将待测样品和褪黑素分别加入到接种CHO-MT1细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种无标记褪黑素膜受体MT1的细胞筛选模型，其特征在于：基于无标记细胞整合药理学技术，利用稳定表达MT1的细胞系CHO-MT1，借助于已知的MT1受体激动剂和拮抗剂，建立MT1受体的细胞筛选模型。/n

【技术特征摘要】
1.一种无标记褪黑素膜受体MT1的细胞筛选模型，其特征在于：基于无标记细胞整合药理学技术，利用稳定表达MT1的细胞系CHO-MT1，借助于已知的MT1受体激动剂和拮抗剂，建立MT1受体的细胞筛选模型。


2.根据权利要求1所述的一种无标记褪黑素膜受体MT1的细胞筛选模型，其特征在于：在细胞兼容的具有光学生物传感功能的384微孔板中接种CHO-MT1细胞，接种的细胞密度为1.0~4.5×104个/孔，细胞培养液体积为40µL/孔，接种后细胞培养时间为18~24h。


3.按照权利要求1所述的一种无标记褪黑素膜受体MT1的细胞筛选模型，其特征在于：具体包括以下步骤：
[1]将溶解在HBSS缓冲盐中的MT1受体激动剂褪黑素以浓度为0.01~50000nM加入到接种CHO-MT1细胞的384微孔板中，检测其DMR特征信号谱；
[2]将溶解在HBSS缓冲盐中的MT1受体拮抗剂Luzindole以浓度为0.01~100000nM加入到接种CHO-MT1细胞的384微孔板中，检测其DMR特征信号谱；
[3]再向步骤[1][2]中加入了褪黑素和Luzindole的细胞板中继续加入与具有最高响应强度对应的最低浓度的褪黑素，分别检测脱敏DMR特征信号谱和拮抗DMR特征信号谱；
[4]获得的所有DMR特征信号谱具有浓度-响应依赖关系且具有灵敏性、饱和性及特异性的特点。


4.根据权利要求1所述的一种无标记褪黑素膜受体MT1的细胞筛选模型，其特征在于，待测样品具有激动活性的筛选步骤如下：：
[1]将溶解在HBSS缓冲盐中的MT1受体激动剂褪黑素以浓度为0.01~50000nM加入到接种CHO-MT1细胞的384微孔板中，检测其DMR特征信号谱；
[2]将待测样品以0.01nM~100µM加入到接种CHO-MT1细胞的微孔板中，检测其DMR信号谱；
[3]关联分析步骤[1]和步骤[2]中的DMR信号谱，若步骤[2]的DMR信号谱与[1]中的DMR特征谱具有轮廓相似性，则进行下一步骤；
[4]将MT1受体拮抗剂Luzind...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁鑫淼，单彩龙，王纪霞，侯滔，薛珍珍，陆金立，
申请(专利权)人：泰州医药城国科化物生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32