一种构建KLF12高表达小鼠的方法及在构建非叶酸依赖的神经管缺陷小鼠模型的应用技术

本发明专利技术公开了一种构建KLF12高表达小鼠的方法及在构建非叶酸依赖的神经管缺陷(neural tube defects,NTDs)小鼠模型的应用，其包括根据Klf12基因序列，利用Cre‑loxP基因重组技术，构建Rosa26

【技术实现步骤摘要】
一种构建KLF12高表达小鼠的方法及在构建非叶酸依赖的神经管缺陷小鼠模型的应用
本专利技术属于生物
，涉及一种构建Krüppel-likefactor12(KLF12)高表达小鼠的方法及在构建非叶酸依赖的神经管缺陷小鼠模型的应用。
技术介绍
神经管缺陷(neuraltubedefects,NTDs)是一种常见的胎儿严重畸形，因妊娠前四周神经管未能完全闭合所致。根据解剖学特点，NTDs主要分为无脑儿、脊膨出、脑膨出和脊柱裂等类型。人们已经证实，叶酸能够参与DNA修复、核苷酸合成和甲基化反应等生物学过程，其缺乏是造成NTDs的主要原因之一。得益于叶酸服用的普及，我国NTDs发生率由1996年的13.6/万，下降至2011年的4.5/万。虽然成效显著，但由于我国人口基数大，每年新增NTDs总例数仍然庞大，这些补充叶酸仍不能避免发生的NTDs病例给家庭和社会造成了严重负担，是全面实现“健康中国”亟待解决的问题之一，有待进一步研究。因此，为了针对非叶酸依赖的NTDs实施有效的诊断及治疗，开发用于非叶酸依赖的NTDs的机理研究与治疗方法研究的生物样本，也就需要合适的动物模型。Cre-LoxP系统是由一个单一的Cre重组酶和被称为LoxP序列的靶向基因敲除序列组成。Cre重组酶有70％的重组效率，不借助任何辅助因子，可作用于多种结构的DNA底物，如线形、环状甚至超螺旋DNA。它是一种位点特异性重组酶，能介导两个LoxP位点(序列)之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。Cre-LoxP重组系统可用于分析转基因动物模型的表型和基因型之间的关系，Cre重组酶可以识别LoxP序列，通过DNA重组的原理，可以将两个LoxP序列之间的片断去除。如果没有Cre，LoxP只是在特定的基因片段两侧，不影响基因片段的活性。一旦Cre酶有活性，就可以把LoxP中间所夹的序列去除，即条件性基因敲除。Cre重组酶介导两个LoxP位点间的重组是一个动态、可逆的过程，可以分成三种情况：1、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列；2、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位；3、如果两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上，Cre酶能介导两条DNA链的交换或染色体易位。但目前现有技术中对于非叶酸依赖的NTDs动物模型的开发和选择还比较少，且效果不够稳定，因此开发一种具有较高临床症状模拟性且较为稳定的非叶酸依赖的NTDs动物模型对筛选候选药物具有重要的意义。
技术实现思路
专利技术目的：目前利用高温、高糖或维甲酸等诱导NTDs小鼠模型的方法成功率均不够稳定，为了克服现有技术中存在的不足，本专利技术提供一种建立非叶酸依赖的神经管缺陷小鼠模型的方法及应用，目的在于对于KLF12高表达的胚胎，该胚胎能够100％出现非叶酸依赖的NTDs表型，可为进一步进行机理研究和药物筛选提供稳定的模型。技术方案：为实现上述目的，本专利技术提供一种构建Klf12基因高表达小鼠的方法，其为根据Klf12基因序列，利用Cre-loxP基因重组技术，构建Rosa26Klf12/Klf12小鼠，包括如下步骤，(1)根据Klf12基因，构建打靶载体，所述打靶载体的序列如SEQIDNO.1所示；(2)ES细胞筛选：复苏MEFs，制作Feeder，复苏ES并传代，用所述打靶载体进行电转，加抗生素筛选后培养，筛选3’和5’端均阳性的克隆细胞；(3)囊胚注射：体外培养2.5d的胚胎，囊胚注射步骤(2)中筛选的3’和5’端均阳性的克隆细胞至胚胎内，体外培养后移植到假孕雌鼠体内，至嵌合鼠诞生作为Funder鼠配种繁殖，通过基因型鉴定可得Rosa26Klf12/Klf12小鼠。优选的，使用的序列还包括如SEQIDNO.9～SEQIDNO.21所示序列中的一种或几种。优选的，所述构建打靶载体，其步骤为，根据Klf12基因，获得线性化套取载体，电转BAC到EL350中，用所述线性化套取载体进行套取；插入1stLoxPsite，进行PCR和酶切鉴定，获得第一纯化质粒；利用Cre/LoxP删除neo；插入2ndLoxPsite，进行PCR和酶切鉴定，获得第二纯化质粒，继续进行PCR和酶切鉴定，线性化后得到打靶载体。本专利技术还提供一种非叶酸依赖的神经管缺陷小鼠模型的构建序列，其包括如SEQIDNO.1、SEQIDNO.9～SEQIDNO.21所示序列中的一种或几种。本专利技术还提供一种非叶酸依赖的神经管缺陷小鼠模型的构建序列的试剂盒。本专利技术还提供一种非叶酸依赖的神经管缺陷小鼠模型的构建方法，其包括如下步骤，将Rosa26Klf12/Klf12小鼠与Sox2Cre雌鼠交配，获得的KLF12高表达胚胎即为非叶酸依赖的神经管缺陷小鼠模型。优选的，所述雌鼠为Sox2Cre。本专利技术还提供一种非叶酸依赖的神经管缺陷小鼠模型的应用，其为在筛选治疗候选药物、保健品中的应用。有益效果：本专利技术利用Cre/LoxP系统首次构建了Rosa26Klf12/Klf12小鼠，并利用该小鼠构建高水平KLF12所致非叶酸依赖的NTDs动物模型，该模型与人类非叶酸依赖的NTDs患者类似，具有很好的临床症状模拟性，利于进行机理研究和药物筛选。附图说明图1小鼠构件策略图，其中图(1)为Rosa26Klf12/Klf12小鼠构建策略，图(2)为获得全身性KLF12高表达小鼠配种繁殖策略。图2为高水平KLF12导致NTDs表型。其中图A-B为免疫荧光检测野生型(wildtype，WT)与KLF12高表达囊胚KLF12蛋白水平，比例尺：20μm；图C为3.5dpcKLF12高表达囊胚计数；图D-E为4.5dpcBlueDye反应显示WT与KLF12高表达胚胎种植位点，图中“▲”所示为种植位点，比例尺：1cm；图F-G为4.5dpcWT与KLF12高表达胚胎种植位点HE染色，“*”所示为胚胎，比例尺：100μm；图H-I为7.5dpcWT与KLF12高表达胚胎种植位点，比例尺：1cm；图J-K为7.5dpcWT与KLF12高表达胚胎种植位点HE染色，“*”所示为胚胎，比例尺：500μm；图L-M为8.5dpcWT与KLF12高表达小鼠胚胎，比例尺：1mm；图N-O为9.0dpcWT与KLF12高表达小鼠胚胎，比例尺：1mm；图P-Q为9.5dpcWT与KLF12高表达小鼠胚胎，比例尺：1mm。图3为高水平KLF12致神经管发育标志分子表达异常，其中图A为9.5dpcWT与KLF12高表达小鼠胚胎HE染色，比例尺：500μm；图B为免疫荧光染色检测9.5dpcWT与KLF12高表达胎鼠神经上皮细胞ARL13B和NKX2.2表达，比例尺：50μm；图C为免疫荧光染色检测9.5dpcWT与KLF12高表达胎鼠神经上皮细胞FOXA2和NKX6.1表达，比例尺：50μm；图D为免疫荧光染色检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种构建KLF12条件性高表达小鼠的方法，其特征在于：根据Klf12基因序列，利用Cre-loxP基因重组技术，构建Rosa26

【技术特征摘要】
1.一种构建KLF12条件性高表达小鼠的方法，其特征在于：根据Klf12基因序列，利用Cre-loxP基因重组技术，构建Rosa26Klf12/Klf12小鼠，包括如下步骤，
(1)根据Klf12基因，构建打靶载体，所述打靶载体的序列如SEQIDNO.1所示；
(2)ES细胞筛选：复苏MEFs，制作Feeder，复苏ES并传代，用所述打靶载体进行电转，加抗生素筛选后培养，筛选3’和5’端均阳性的克隆细胞；
(3)囊胚注射：体外培养2.5d的胚胎，囊胚注射步骤(2)中筛选的3’和5’端均阳性的克隆细胞至胚胎内，体外培养后移植到假孕雌鼠体内，至嵌合鼠诞生作为Funder鼠配种繁殖，通过基因型鉴定可得Rosa26Klf12/Klf12小鼠。


2.如权利要求1所述的构建KLF12条件性高表达小鼠的方法，其特征在于：使用的序列还包括如SEQIDNO.9～SEQIDNO.21所示序列中的一种或几种。


3.如权利要求1所述的构建KLF12条件性高表达小鼠的方法，其特征在于：所述构建打靶载体，其步骤为，
根据Klf12基因，获得线性化套取载体，电转BAC到EL350中，...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙海翔，颜桂军，刘洋，
申请(专利权)人：南京鼓楼医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32