一种从孕妇宫颈脱落细胞中分离胎盘滋养层细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种从孕妇宫颈脱落细胞中分离胎盘滋养层细胞的方法。该方法基于研究确定的滋养层细胞表面或胞内表达的特异性抗原及组合，并利用设计的微流控分选芯片或流式细胞仪，对胎盘滋养层样本的细胞悬浮液进行细胞分选，获得分离纯化的胎盘滋养层细胞。本发明专利技术与传统方法相比，具有无创获取标本和特异性好的优势，而且该方法取材时间较早，导致感染及流产的风险低，能实现同时对多个抗原进行同步标记和特征荧光信号的识别和分选，准确性得到较大提升，检测结果又具有更高的可信度和更广的覆盖范围。

【技术实现步骤摘要】
一种从孕妇宫颈脱落细胞中分离胎盘滋养层细胞的方法
本专利技术属于细胞分离
更具体地，涉及一种从孕妇宫颈脱落细胞中分离筛选滋养层细胞的方法。
技术介绍
孕前、产前和新生儿三级防控体系是我国降低出生缺陷、提高人口素质的重要手段之一，其中产前筛查和诊断是最为复杂且难度最高的环节。目前临床上用于产前诊断的羊膜腔穿刺术或者脐静脉穿刺术，以及胎儿游离核酸测序等无创产前筛查技术都存在各种不足；羊膜腔穿刺术或者脐静脉穿刺术取材方法操作感染和流产的风险高、分析时间长，检测项目和范围有限，而且诊断时间限制在孕中晚期，孕妇的接受度低且不利于临床处理。胎儿游离核酸测序技术检验范围极其有限，且存在仅可检测3-5条指定染色体倍性，假阳性、假阴性情况难以避免，对常见变异检出能力不足，母血胎儿游离核酸的含量也存在个体差异性等问题。申请人的专利申请CN111304153A披露了一种分离滋养层细胞的方法，该方法通过确定滋养层细胞表面表达的特异性抗原，利用带有对应特异性抗体的免疫磁珠技术，从胎盘滋养层样本细胞悬浮液中分离纯化胎盘滋养层细胞。该技术与传统的羊膜腔穿刺和绒毛穿刺相比，具有无创的优势，且取材时间较早，感染及流产的风险低，检测结果又具有相似的可信度。另一方面看，该技术仍有改进的空间，所披露适用的抗体组合有限，准确性和特异性扔有待更好的提升。申请人团队对该项目一直在进行持续的研究开发。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于流式细胞分离或微流控技术从孕妇宫颈脱落细胞中分离筛选滋养层细胞的方法，不仅克服传统方法的问题和缺陷，还可实现同时对更多多个抗原进行同步标记和特征荧光信号的识别和分选，准确性得到较大提升，同时特异性也优于之前的免疫磁珠法分离方案。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：一种分离滋养层细胞的方法，包括如下步骤：(1)将宫颈脱落细胞液样本制备成样本细胞悬浮液；(2)向样本细胞悬浮液中加入特异性抗体进行孵育；所述特异性抗体是对应滋养层细胞表面或胞内表达的特异性抗原的抗体组合；优选地特异性抗体组合为HLA-G+CK7、HLA-G+CK18、HLA-G+β-HCG、CD31+HPL、MMP9+CD31、HLA-G+HPL、HLA-G+MMP9、HLA-G+CD31、HLA-G+P、CD31+P、HLA-G+CDH5、CD31+CDH5、CD31+CK7+HLA-G、HLA-G+CK18+CD31、HLA-G+β-HCG+CD31、CD31+HPL+HLA-G、MMP9+CD31+HLA-G、CD31+P+HLA-G或HLA-G+CDH5+CD31的组合；(3)利用流式细胞仪将步骤(2)孵育完成的细胞重悬液进行分选，即可获得分离纯化的胎盘滋养层细胞；或利用微流控分选芯片，将步骤(2)孵育完成的细胞重悬液进行荧光标记微流控细胞分选，即可获得分离纯化的胎盘滋养层细胞。优选地，步骤（3）所用微流控分选芯片的结构为：包括基片和与之贴合的盖片；选用包括但不限于亚克力作为基本材质通过注塑成型技术制成；所述基片的一面上设有主流道、侧流道A和侧流道B，两个侧流道分别对应靠近主流道的左、右两端部；所述基片的另一面上设有C入口、S入口、N出口和T出口；四个口均贯穿到基片另一面与流道连通；且C入口的位置对应于主流道的左端部，S入口的位置对应于侧流道A端部，N出口的位置对应于主流道的右端部，T出口的位置对应于侧流道B端部；所述主流道内、在N出口与T出口汇合处，还设有偏转电极装置。优选地，所有主流道、侧流道A和侧流道B的流道宽度均不超过1000μm，深度均不超过500μm。更优选地，所有主流道、侧流道A和侧流道B的流道宽度均为500-1000μm。更优选地，所有主流道、侧流道A和侧流道B的流道宽度均为1000μm。微流控分选芯片中，C入口可通入待分选混合细胞样品、S入口可通入缓冲液、T出口为目标细胞收集，N出口为非目标细胞收集。分选过程中，含有目标细胞的混合样品由C入口处流入芯片主流道，缓冲液于S入口进入芯片侧流道，二者在流道交汇处混合后继续沿主流道向同一方向流动。混合细胞流经偏转电极装置时，以电极开闭控制进入的管道，目标细胞被分选而到达T出口，而非目标细胞则沿主流道继续到达N出口，分选完成。另外，优选地，步骤(2)中一抗孵育条件为：4℃反应30-90min（优选4℃，60min），二抗-荧光标记复合物孵育条件为2℃-8℃反应20min。优选地，步骤(2)的具体方法是：通过孵育将一抗、二抗-荧光标记复合物先后分步与目标抗原进行特异性连接，中间使用洗涤和离心分离技术避免交叉污染。优选地，步骤(3)的具体方法是：孵育完成的细胞重悬液通入微流控分选芯片的C入口，并在S入口通入缓冲液；然后将微流控分选芯片放置于细胞分选仪并运行分选程序，程序结束后，搜集T出口的标本，获得分选的滋养层细胞。优选地，步骤(3)中细胞分选液相体系为0.2%-0.4%Triton-X-100(优选0.3%Triton-X-100)。更优选地，利用PBS配置。优选地，步骤（3）所述利用流式细胞仪进行分选的条件：调整上样速度为1000-2000events/秒，收集速率为5.0。优选地，步骤(1)中细胞悬浮液的最佳体系为含0.2%-0.4%FBS的1xPBS（优选含0.3%FBS的1xPBS）。另外所述方法在构建人类STR鉴定、人类染色体倍性检测、地中海贫血基因检测、耳聋基因检测、全外显子组基因测序、染色体微缺失/重复检测(高通量测序法)、或染色体结构变异检测(高密度芯片法)的产品方面的应用，也应当在本专利技术的保护范围之内。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供的基于流式细胞分离或微流控技术分离胎盘滋养层细胞的方法，与传统的羊膜腔穿刺和绒毛穿刺相比，具有无创获取标本的优势，且取材时间较早，感染及流产的风险低，检测结果又具有更高的可信度和更广的覆盖范围。通过该种类的标本可获取胎儿完整的基因组核酸样本，使检测分析所有遗传性疾病成为可能。对技术人员和实验室设备的要求不高，可在更多的医疗机构开展，能够得到大范围的推广。本专利技术提供的方法，与申请人另一技术(专利申请CN111304153A披露的方法)相比，本方法能实现同时对更多多个抗原进行同步标记和特征荧光信号的识别和分选，准确性得到较大提升，同时特异性也更好。附图说明图1为微流控分选芯片的基片结构示意图；(a)图和(b)图分别为基片的两个面。图2为流式细胞分选中选择的单荧光标记阳性细胞群。图3为流式细胞分选中选择的双荧光标记阳性细胞群。图4为FAM标记的通道1，“822-”为分选后剩余标本，“822+”为分选出的标本，“822”为分选前标本。图5为HEX标记的通道2。图6为TAMRA标记的通道3。图7为ROX标记的通道4。图8为对分选后合体滋养层细胞中含有Y染色体的标本进行Y-ST本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离滋养层细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)将宫颈脱落细胞液样本制备成样本细胞悬浮液；/n(2)向样本细胞悬浮液中加入特异性抗体进行孵育；/n所述特异性抗体是对应滋养层细胞表面或胞内表达的特异性抗原的抗体组合，即HLA-G+CK7、HLA-G+CK18、HLA-G+β-HCG、CD31+HPL、MMP9+CD31、HLA-G+HPL、HLA-G+MMP9、HLA-G+CD31、HLA-G+P、CD31+P、HLA-G+CDH5、CD31+CDH5、CD31+CK7+HLA-G、HLA-G+CK18+CD31、HLA-G+β-HCG+CD31、CD31+HPL+HLA-G、MMP9+CD31+HLA-G、CD31+P+HLA-G或HLA-G+CDH5+CD31的特异性抗体组合；/n(3)利用流式细胞仪将步骤(2)孵育完成的细胞重悬液进行荧光标记分选，获得分离纯化的胎盘滋养层细胞；/n或利用微流控分选芯片，将步骤(2)孵育完成的细胞重悬液进行荧光标记微流控细胞分选，获得分离纯化的胎盘滋养层细胞。/n

【技术特征摘要】
1.一种分离滋养层细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将宫颈脱落细胞液样本制备成样本细胞悬浮液；
(2)向样本细胞悬浮液中加入特异性抗体进行孵育；
所述特异性抗体是对应滋养层细胞表面或胞内表达的特异性抗原的抗体组合，即HLA-G+CK7、HLA-G+CK18、HLA-G+β-HCG、CD31+HPL、MMP9+CD31、HLA-G+HPL、HLA-G+MMP9、HLA-G+CD31、HLA-G+P、CD31+P、HLA-G+CDH5、CD31+CDH5、CD31+CK7+HLA-G、HLA-G+CK18+CD31、HLA-G+β-HCG+CD31、CD31+HPL+HLA-G、MMP9+CD31+HLA-G、CD31+P+HLA-G或HLA-G+CDH5+CD31的特异性抗体组合；
(3)利用流式细胞仪将步骤(2)孵育完成的细胞重悬液进行荧光标记分选，获得分离纯化的胎盘滋养层细胞；
或利用微流控分选芯片，将步骤(2)孵育完成的细胞重悬液进行荧光标记微流控细胞分选，获得分离纯化的胎盘滋养层细胞。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微流控分选芯片包括基片和与之贴合的盖片；
所述基片的一面上设有主流道、侧流道A和侧流道B，两个侧流道分别靠近主流道的左、右两端部；
所述基片的另一面上设有C入口、S入口、N出口和T出口；四个口均贯穿到基片另一面与流道连通；且C入口的位置对应于主流道的左端部，S入口的位置对应于侧流道A端部，N出口的位置对应于主流道的右端部，T出口的位置对...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑焱，马佳艳，丰晓威，刘梦羽，陈佩璇，管秩生，谢龙旭，葛毅媛，
申请(专利权)人：广州凯普医药科技有限公司，广东凯普生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44