牛体外受精胚胎培养和冻存的方法技术

本发明专利技术涉及牛体外受精胚胎培养和冻存的方法，其包括如下步骤：将成熟的卵丘‑卵母细胞复合体在受精培养液中洗涤，再转移到受精培养液中，放入培养箱中，备用；从液氮中取冻精细管，解冻后取精子悬液进行精子计数；将精子悬液加入盛有卵母细胞的受精培养液滴中使精卵共孵育，完成体外受精操作，将胚胎周围的颗粒细胞用剥卵针去除干净，放入胚胎培养液中培养，接着将可用胚胎转移入冷冻液，置入液氮中冷冻保存；在需要使用冷冻保存的胚胎时，从液氮中取出细管，移入解冻液中，将胚胎放入胚胎培养液小滴内培养，完成解冻过程。本发明专利技术还涉及所用的冷冻液和解冻液。本发明专利技术方法能够显著提高牛体外受精胚胎冻存和解冻后的存活率。

【技术实现步骤摘要】
牛体外受精胚胎培养和冻存的方法
本专利技术属于动物繁殖
，涉及一种用于农业-畜牧兽医繁殖的技术，具体涉及一种牛体外受精的方法，另外，本专利技术还涉及牛体外受精中使用的相关工作试液在牛体外受精中的应用，尤其是，涉及一种牛体外受精的方法，例如涉及一种具有优良效果的牛体外受精囊胚冻存和解冻的方法。本专利技术牛体外受精的方法具有优异的技术效果。
技术介绍
体外受精(InVitroFertilization)或(externalfertilization)是指哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术，英文简称为IVF。由于它与胚胎移植技术(ET)密不可分，又简称为IVF-ET。在生物学中，把体外受精胚胎移植到母体后获得的动物称试管动物(test-tubeanimal)。这项技术成功于20世纪50年代，在最近20年发展迅速，现已日趋成熟而成为一项重要而常规的动物繁殖生物技术。体外受精技术对动物生殖机理研究、畜牧生产、医学和濒危动物保护等具有重要意义。如用小鼠、大鼠或家兔等作实验材料，体外受精技术可用于研究哺乳动物配子发生、受精和胚胎早期发育机理。在家畜品种改良中，体外受精技术为胚胎生产提供了廉价而高效的手段，对充分利用优良品种资源，缩短家畜繁殖周期，加快品种改良速度等有重要价值。在人类，IVF-ET技术是治疗某些不孕症和克服性连锁病的重要措施之一。体外受精技术还是哺乳动物胚胎移植、克隆、转基因和性别控制等现代生物技术不可缺少的组成部分。随着现代农业科技的发展，为了更充分利用良种母牛的繁殖潜力，加速遗传育种进程，在生产实践中应用高效的繁殖新技术成为必然。活体采卵(OvumpickUP，OPU)和体外受精技术(InVitroFertilization，IVF)是二十世纪八十年代快速发展起来的胚胎工程新技术，二者相结合可获得大量遗传系谱明确的胚胎，从而缩短世代间隔。目前，这两种技术已经成为欧美和大洋洲等畜牧业发达国家的农场主为扩大良种母牛群而采用的重要繁殖技术。然而，采用常规的牛胚胎培养体系(CR1aa和SOF液)，牛体外受精的囊胚发育率较低，而且胚胎质量也远不及体内胚胎，导致胚胎移植受体后的妊娠率低，因此如何提高囊胚发育率及胚胎质量成为体外受精胚胎生产的重点和研究的焦点。早在1878年，德国人Scnenk就以家兔和豚鼠为材料，开始探索哺乳动物的体外受精技术。但直到1951年，美籍华人张民觉和Austin分别发现精子体外获能现象后，体外受精技术才获得了突破性进展。牛体外受精技术受到卵母细胞的体外成熟、精子的体外获能、受精卵的体外培养环境等多个方面的影响。胚胎的体外培养是IVF技术的一个关键环节，亦是卵母细胞体外成熟和体外受精技术最终效果的体现和检验。在体外受精后，受精卵在向囊胚发育过程中将需经历一系列重要的变化，包括合子的形成、第一次卵裂、胚胎基因组的激活、致密化以及形成囊胚。这一过程中，外界环境的变化会导致基因表达发生改变，从而影响胚胎的正常发育及质量。目前，哺乳动物早期胚胎的体外培养研究主要集中在改善培养液成分以满足不同发育阶段的胚胎营养需求。基于Rosenkrans等(Rosenkrans，C.F.，Jr.andN.L.First，Effectoffreeaminoacidsandvitaminsoncleavageanddevelopmentalrateofbovinezygotesinvitro.JAnimSci，1994.72(2):p.434-7)开发的CharlesRosenkrans1(CR1)培养液和Tervit等(Tervit，H.R.，D.G.Whittingham，andL.E.Rowson,Successfulcultureinvitroofsheepandcattleova.JReprodFertil,1972.30(3):p.493-7)开发的合成输卵管液(SyntheticOviductalFluid，SOF)，经多年不断改进逐步形成了两种培养体系。据HakanSagirkaya等(Sagirkaya,H.,etal.,Developmentalpotentialofbovineoocytesculturedindifferentmaturationandcultureconditions.AnimReprodSci,2007.101(3-4):p.225-40)和Somfai等(Somfai,T.,etal.,DevelopmentofbovineembryosculturedinCR1aaandIVD101mediausingdifferentoxygentensionsandculturesystems.ActaVetHung,2010.58(4):p.465-74)研究成果表明，CR1aa培养液用于牛胚胎培养有较好的效果，可以广泛应用于牛的胚胎培养；Thompson,J.G.等(Thompson,J.G.,etal.,Effectofinhibitorsanduncouplersofoxidativephosphorylationduringcompactionandblastulationofbovineembryosculturedinvitro.JReprodFertil,2000.118(1):p.47-55)和JeanM.Feugang等(Feugang,J.M.,O.Camargo-Rodriguez,andE.Memili,Culturesystemsforbovineembryos.LivestockScience,2009.121(2-3):p.141-149)的研究结果显示，SOF培养液也是一种适合于牛胚胎培养的培养体系。张志平等(张志平,安志兴,张锈,张涌,牛胚胎培养体系的优化.西北农林科技大学学报,2006.34)和桑国俊等(桑国俊,牛卵母细胞及体外胚培养技术研究.2008)研究结果也显示，经过优化的CR1aa和SOF培养液均适合于牛的体外胚胎培养，均取得良好的培养效果。哺乳动物早期胚胎发育是一个高度协调且精确调节的过程。在进化过程中，配子细胞逐步形成了一系列的分子级联网络，以保证胚胎发育周期系统地进行。在发育过程中，胚胎的内外活性氧自由基(ReactiveOxygenSpecies，ROS)与抗氧化剂的平衡对早期胚胎发育起着决定性作用。大多生化反应均产生ROS，其在细胞内、外均有着重要的作用，一部分ROS起着信号分子的作用，但是大多数ROS对机体是有害的。Brooker,R.J.等(Brooker,R.J.,Genetics:analysisandprinciples(4thed.).McGraw-HillScience,2011)报道，ROS可以引起细胞DNA损伤、不饱和脂肪酸的氧化、蛋白质中氨基酸的氧化甚至可以导致某些酶的失活。一般来说，ROS以四种形式存在，其中H2O2氧化作用较强，是引起氧化伤害的最主要因素。大量研究表明，谷胱甘肽(GSH)是以非蛋白质形式存在的一种抗氧化剂，能够清除多种自由基：超氧阴离子自由基、羟基自由基、过本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.牛体外受精胚胎培养和冻存的方法，其包括如下步骤：/n将成熟的卵丘-卵母细胞复合体在受精培养液中洗涤1次，再转移到受精培养液中，放入培养箱中，备用；/n从液氮中取一支冻精细管，37℃水浴解冻；无菌操作剪开细管两端，使精液注入盛有精液制备培养液的15mL离心管中，328×g离心2次，每次5min，离心后弃上清；将300µL精液制备培养液加入上述离心管，重悬精子沉淀，取适当的精子悬液进行精子计数；/n将计算好体积的精子悬液加入盛有卵母细胞的受精培养液滴中，并将培养盘放入培养箱，使精卵共孵育16-20h，培养条件为38.8℃、5.5-6.5% CO

【技术特征摘要】
1.牛体外受精胚胎培养和冻存的方法，其包括如下步骤：
将成熟的卵丘-卵母细胞复合体在受精培养液中洗涤1次，再转移到受精培养液中，放入培养箱中，备用；
从液氮中取一支冻精细管，37℃水浴解冻；无菌操作剪开细管两端，使精液注入盛有精液制备培养液的15mL离心管中，328×g离心2次，每次5min，离心后弃上清；将300µL精液制备培养液加入上述离心管，重悬精子沉淀，取适当的精子悬液进行精子计数；
将计算好体积的精子悬液加入盛有卵母细胞的受精培养液滴中，并将培养盘放入培养箱，使精卵共孵育16-20h，培养条件为38.8℃、5.5-6.5%CO2、饱和湿度，完成体外受精操作；
体外受精操作完毕后，将胚胎周围的颗粒细胞用剥卵针去除干净，放入胚胎培养液中培养，此时记为胚胎培养的第1天，培养条件为38.8℃、6%O2、88%N2、饱和湿度，第3天记录卵裂率；第7天记录囊胚率，至第9天时统计囊胚孵化率，并进行质量鉴定；
将可用胚胎在保存液中洗涤3次，在平衡液中平衡10min后转移入冷冻液，按5段装液法装入胚胎，做好标记，再放入程序降温仪中按照0.5℃/min的速度降至-35℃后，将胚胎细管迅速取出，置入液氮中冷冻保存；
在需要使用冷冻保存的胚胎时，从液氮中取出细管，在空气中停留5s，放入37°C水浴中，待冰晶全部融化为止，剪开细管，将胚胎迅速移入解冻液中，室温下保持5min，然后将胚胎放入胚胎培养液小滴内培养，完成解冻过程；
其中，
所述受精培养液是包含112.0mM氯化钠、4.02mM氯化钾、2.25mM的氯化钙二水合物、0.52mM六水氯化镁、0.83mM磷酸二氢钾、37.0mM碳酸氢钠、1.25mM丙酮酸钠、10μg/ml肝素、4mg/ml牛血清白蛋白、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、10umoL/Lα-硫辛酸、25μg/ml叶酸、3mg/ml谷氨酸钠的水溶液，
所述精液制备培养液是包含112.0mM氯化钠、4.02mM氯化钾、2.25mM的氯化钙二水合物、0.52mM六水氯化镁、0.83mM磷酸二氢钾、37.0mM碳酸氢钠、1.25mM丙酮酸钠、10μg/ml肝素、4mg/ml牛血清白蛋白、10mM咖啡因、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、10umoL/Lα-硫辛酸、25μg/ml叶酸、3mg/ml谷氨酸钠的水溶液，
所述冷冻液的组成为：PBS+20%FBS+1.8mol/L乙二醇+0.25mol/L蔗糖+0.2%右旋糖酐40+5mmol/L乙酰半胱氨酸，
所述解冻液的组成为：PBS+20%FBS+0.25mol/L蔗糖+0.2%右旋糖酐40+5mmol/L乙酰半胱氨酸。


2.根据权利要求1的方法，其中所述卵丘-卵母细胞复合体是通过如下方法采集和体外成熟的：
a)离体采集：取屠宰场所得牛卵巢，抽取表面2-8mm的卵泡，收集沉淀，在体视显微镜下捡出至少含有3层卵丘细胞包裹的卵母细胞COCs即卵丘-卵母细胞复合体，放入包含HEPES的运输培养液中38.8℃、无二氧化碳供应、24h内运回实验室；
b)将以上离体采集所得COCs在卵母细胞成熟培养液中洗涤1次，再转移到新的成熟培养液中培养22-24h，培养条件为38.8℃、5.5-6.5%CO2、饱和湿度，得到成熟的卵丘-卵母细胞复合体。


3.根据权利要求2的方法，所述成熟培养液是添加了100mL/LFBS、10μg/mLFSH、10μg/mLLH、1μg/mLE2、20ng/mLEGF的BY基础培养液。


4.根据权利要求2的方法，所述运输培养液中包含：甘氨酸50.0mg/L、L-丙氨酸25.0mg/L、L-精氨酸盐酸盐70.0mg/L、L-天冬氨酸30.0mg/L、L-胱氨酸二盐酸盐26.0mg/L、L-谷氨酸75.0mg/L、L-谷氨酰胺100.0mg/L、L-组氨酸盐酸盐一水合物21.88mg/L、L-羟基脯氨酸10.0mg/L、L-异亮氨酸40.0mg/L、L-亮氨酸60.0mg/L、L-赖氨酸盐酸盐70.0mg/L、L-甲硫氨酸15.0mg/L、L-苯丙氨酸25.0mg/L、L-脯氨酸40.0mg/L、L-丝氨酸25.0mg/L、L-苏氨酸30.0mg/L、L-色氨酸10.0mg/L、L-酪氨酸二钠盐二水合物58.0mg/L、L-缬氨酸25.0mg/L、抗坏血酸0.05mg/L、生物素0.01mg/L、氯化胆碱0.5mg/L、D-泛酸钙0.01mg/L、叶酸0.01mg/L、甲萘醌0.01mg/L、烟酰胺0.025mg/L、烟酸0.025mg/L、对氨基苯甲酸0.05mg/L、盐酸吡哆醛0.025mg/L、盐酸吡哆醇0.025mg/L、核黄素0.01mg/L、盐酸硫胺素0.01mg/L、维生素A醋酸酯0.1mg/L、维生素D2即骨化醇0.1mg/L、α-生育酚磷酸钠盐0.01mg/L、肌醇0.05mg/L、无水氯化钙200.0mg/L、硝酸铁九水合物0.7mg/L、无水硫酸镁97.67mg/L、氯化钾400.0mg/L、氯化钠6800.0mg/L、磷酸二氢钠一水合物140.0mg/L、硫酸腺嘌呤10.0mg/L、5'-磷酸腺苷0.2mg/L、三磷酸腺苷1.0mg/L、胆固醇0.2mg/L、葡萄糖1000.0mg/L、脱氧核糖0.5mg/L、还原型谷胱甘肽0.05mg/L、盐酸鸟嘌呤0.3mg/L、次黄嘌呤钠0.354mg/L、酚红20.0mg/L、核糖0.5mg/L、醋酸钠50.0mg/L、胸腺嘧啶0.3mg/L、吐温80为20.0mg/L、尿嘧啶0.3mg/L、黄嘌呤钠0.3mg...

【专利技术属性】
技术研发人员：王娜，王小武，韩勇权，郝少强，赵明礼，郭春明，许晓椿，
申请(专利权)人：天津博裕力牧科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12