草莓炭疽病菌C·siamense特异性PCR检测引物及其检测方法与应用技术

本发明专利技术提供草莓炭疽病致病菌

【技术实现步骤摘要】
草莓炭疽病菌C·siamense特异性PCR检测引物及其检测方法与应用
本专利技术涉及草莓炭疽病菌C·siamense特异性PCR检测引物及其检测方法，专用于草莓炭疽病菌快速、灵敏和特异的分子检测，同时可用于田间草莓炭疽病的早期诊断和病菌的检测和鉴定，属于农作物病害检测、鉴定及防治

技术介绍
近年来，我国草莓产业发展迅速，为主产区带来了显著的经济效益和社会效益，但病害的发生对草莓的产量和品质造成了巨大的损失。其中，由胶孢炭疽菌复合种（Colletotrichumgloeosporioides(Penz.)Penz.&Sacc.）内的C•siamense引起的炭疽病（Anthracnose）是目前草莓生产中极具威胁的重要病害之一，在我国江苏、浙江、上海、湖北等地均有该病普遍发生的报道。该病可以侵染草莓的各个部位，引起叶斑、芽腐、花腐等症状，当根颈被侵染时可导致整个草莓植株死亡，起初是叶片萎蔫下垂，后逐渐枯死。草莓整个生长期均可受该病危害，尤以育苗期和移栽初期发病最重。该病的致病菌可以菌丝体或分生孢子盘的形式生活或潜伏在植株上，种苗、土壤、植物残体及中间寄主均可成为感染源，若能检测及监测田间病原菌的感染源，将有助于此该病的预防及管控。草莓炭疽病菌的传统检测主要依赖组织培养与形态鉴定，这种方法耗时长、程序繁琐、灵敏度低、经验依赖性强，从植物组织上培养出分生孢子通常需要5-7天的时间，检测的成功与否还受采样部位、消毒条件等影响，难以做到对及时、准确的监控。随着分子生物学技术的发展，利用真菌核糖体转录间隔区（internaltranscribedspacer，ITS）序列的种内保守性、种间可变性及多拷贝的特点，设计特异引物进行聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）扩增，对病原菌进行快速检测和鉴定的技术已得到广泛应用。国内外已有研究人员利用ITS基因作为病原菌检测靶标，开发出了链格孢菌（Alternariaalternaria）、苹果腐烂病菌（Valsamalivar.mali）、尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum）等不同病原菌的特异性检测引物，进行病原菌的快速、准确检测和鉴定，在草莓上也有尖孢炭疽菌（C.acutatumJ.H.Simmonds）、灰霉病菌（Botrytiscinerea）、C.cingulata等病原菌分子快速检测研究，但目前，关于草莓炭疽病的另一种常见致病菌C•siamense，尚无相关特异、快速PCR检测报道。本专利技术通过对炭疽菌属（Colletotrichum）的ITS序列进行比对分析，设计出一对可用于特异性检测C•siamense的引物，为草莓炭疽病的准确鉴定和快速检测提供技术和方法，有利于及早有效地采取防治措施。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中对草莓炭疽病菌的检测和鉴定，主要基于形态学特征，方法耗时长、程序繁琐、经验性强、准确度低，难以做到对病害发生的及时检测，继而控制病原菌的传播、流行的问题，提供了一种草莓炭疽病菌特异性PCR检测引物及其检测方法，利用本专利技术所述的PCR检测引物和检测方法检测草莓炭疽病菌准确性高、特异性强、灵敏度高、易于操作、检测时间短且结果可靠。技术方案：为实现本专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案：1.通过测定草莓炭疽病菌（Colletotrichumsiamense）和草莓植株及生长介质中其它真菌的核糖体转录间隔区（ITS）序列，对草莓植株及生长环境中不同真菌的ITS序列进行比对分析，设计出对草莓炭疽病菌C•siamense具有特异性扩增的1对引物，其序列为：上游引物CgInt：5’-GGCCTCCCGCCTCCGGGCGG-3’下游引物Cg478R：5’-TTTACGGCAAGAGTCCCTCC-3’对草莓炭疽病菌特异性扩增出389bp的产物。一种草莓C•siamense检测方法，包括以下步骤：（1）从感染C•siamense的草莓组织中提取DNA；（2）以步骤（1）提取的DNA为模板，利用CgInt/Cg478R这一对引物进行PCR扩增，第一轮取步骤（1）提取的DNA原液做模板进行单重PCR扩增，第二轮取第一轮PCR产物作为PCR反应模板进行PCR扩增；（3）取3μL步骤（2）的PCR扩增产物用琼脂糖凝胶进行电泳分离，电压为70-100V，然后于紫外灯下观察，根据扩增产物的有无及其片段大小对结果进行判断，如果能特异性地扩增出389bp的条带，即可判断检测草莓样品中存在C•siamense。作为优选方案：草莓C•siamense检测方法，包括以下步骤：（1）感染C•siamense的草莓叶片DNA的提取检测草莓植株中C•siamense前，采用新型植物基因组提取试剂盒（天根，中国）提取总DNA，方法参考说明书，取0.5μL作为PCR模板进行扩增。（2）以步骤（1）提取的DNA为模板，利用CgInt/Cg478R这一对引物进行PCR扩增。PCR反应体系10μL，包括5μLEsTaqMasterMix（康为世纪，中国），0.5μLDNA模板（20ng/μL），正反向引物各0.25μL（10μM），10%甘油。扩增程序为：96oC变性5min；96oC变性30s，50oC退火45s，72oC延伸1min，30个循环；最后72oC延伸7min。（3）取步骤（2）的PCR扩增产物3.0μL用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳分离，GoldView染色，70-100V，40min后于紫外灯下观察，根据扩增产物的有无及其片段大小对结果进行判断，如果能特异性地扩增出约389bp的产物，即可判断所述的检测样品中存在C•siamense，否则所述的检测样品中不存在C•siamense。本专利技术的关键技术是草莓炭疽病菌C•siamense高效特异性PCR检测引物的设计及其检测方法的建立。为了获得C•siamense的特异PCR检测引物序列，以发病草莓植株中分离到的C•siamense及草莓生长介质与植株中常见真菌为供试材料，采用新型植物基因组提取试剂盒（天根，中国）提取供试菌株基因组DNA，具体方法参考说明书。以真菌核糖体基因转录间隔区（ITS）通用引物ITS5：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’和ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’对供试菌株的ITS片段进行扩增，PCR反应体系50μL，包括25μLEsTaqMasterMix（康为世纪，中国），2μLDNA模板（20ng/μL），正反向引物各1.25μL（10μM），10%甘油，不足部分用无菌超纯水补足。扩增程序为：96oC变性5min；96oC变性30s，50oC退火45s，72oC延伸1min，30个循环；最后72oC延伸7min。将PCR扩增产物送至南京擎科生物科技有限公司进行测序，将测序得到的草莓炭疽病菌（C•siamense）的ITS序列与GenBank中Colletotrichum属20个不同种以及24个对照菌株本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.草莓炭疽病菌C·siamense特异性PCR检测用引物，其特征在于：引物序列为：/n上游引物CgInt：5’-GGCCTCCCGCCTCCGGGCGG-3’/n下游引物Cg478R：5’-TTTACGGCAAGAGTCCCTCC-3’/n对草莓炭疽病菌C·siamense特异性扩增出389 bp的产物。/n

【技术特征摘要】
20210206 CN 20211016554051.草莓炭疽病菌C·siamense特异性PCR检测用引物，其特征在于：引物序列为：
上游引物CgInt：5’-GGCCTCCCGCCTCCGGGCGG-3’
下游引物Cg478R：5’-TTTACGGCAAGAGTCCCTCC-3’
对草莓炭疽病菌C·siamense特异性扩增出389bp的产物。


2.一种草莓C·siamense检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）从感染C·siamense的草莓组织中提取DNA；
（2）以步骤（1）提取的DNA为模板，利用CgInt/Cg478R这一对引物进行PCR扩增，第一轮取步骤（1）提取的DNA原液做模板进行单重PCR扩增，第二轮取第一轮PCR产物作为PCR反应模板进行PCR扩增；
（3）取3μL步骤（2）的PCR扩增产物用琼脂糖凝胶进行电泳分离，电压为70-100V，然后于紫外灯下观察，根据扩增产物的有无及其片段大小对结果进行判断，如果能特异性地扩增出389bp的条带，即可判断检测草莓样品中存在C·siamense。

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【专利技术属性】
技术研发人员：唐冬兰，曹荣祥，蒋立奔，唐泉，韩金龙，童晓利，孙永平，朱儆元，
申请(专利权)人：江苏丘陵地区南京农业科学研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32