SPL3和miR156基因在鉴定抗从枝病泡桐的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗丛枝病泡桐的早期分子鉴定方法，其中，包含获取泡桐叶片RNA；PCR检测并分析miR156和SPL3的表达量；预判其抗病性。本发明专利技术首次对抗丛枝病泡桐进行早期鉴定，该发明专利技术有助于抗丛枝病泡桐的选育，在泡桐育种上有巨大价值。

【技术实现步骤摘要】
SPL3和miR156基因在鉴定抗从枝病泡桐的应用
本专利技术涉及分子生物学
，更具体地说是涉及一种抗丛枝病泡桐的早期鉴定方法。
技术介绍
泡桐，又叫白花泡桐、大果泡桐，空桐木等，树皮灰色、灰褐色或灰黑色，幼时平滑，老时纵裂。假二杈分枝，单叶，对生，叶大，卵形，全缘或有浅裂，具长柄，柄上有绒毛；喜光，较耐阴，喜温暖气候，耐寒性不强。其生长速度快，耐瘠薄，材性优良，在防风固沙、保障粮食安全和木材供应等方面起着重要的作用。泡桐丛枝病是泡桐生产中最严重的病害之一，感病的幼苗、幼树常于当年枯死，大树感病后会引起树势衰退，材积生长量大幅度下降甚至造成死亡。目前，，丛枝病的防治目前费时费力，培育抗丛枝病的泡桐品种才是预防的根本，因此，开展抗丛枝病泡桐的选育是有必要的。因此，如何对抗丛枝病泡桐进行早期的分子鉴定是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术以SPL3和miR156基因在泡桐树中的表达量为指标对抗从枝病的泡桐进行鉴定，简单高效。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：SPL3和miR156基因在以Real-TimePCR方法鉴定抗从枝病泡桐中的应用。miR156的靶基因为SPL，miR156和SPL特定存在于植物中，对于维持植物的生长发育、非生物胁迫和合成代谢具有关键作用，miR156对SPL3具有调控作用，而且miR156对SPL3的调控主要通过SPL3蛋白翻译后的抑制来实现的，所以在同一时期，植物体内miR156和SPL3基因的表达量呈相反趋势。MiR156通过切割SPL3转录本来影响枝条分支和植物构型。miR156的过表达促进了腋芽的萌生和生长，同时抑制了SAM的活性，导致了矮化植物的表型。SPL3通过影响独脚金内酯的信号传导进而调控植物的分枝。在选育过程中，miR156表达量较低同时SPL3表达量较高的候选植株，其出现丛枝症状的可能性较低。一种鉴定抗从枝病泡桐的引物，以SPL3和miR156基因进行鉴定，且所述引物序列如SEQIDNO.1～SEQIDNO.3所示；miR156F-5P-qF：GACAGAAGATAGAGAGCACAA，如SEQIDNO.1所示；miR156F-5P-qR：GeneCopoeia公司的All-in-OneTMmiRNAqRT-PCRDetectionKit试剂盒配有下游通用引物UniversalAdaptorPCRPrimer；pau-SPL3-qF:TTCTGTCATCTAACTCTTG，如SEQIDNO.2所示；pau-SPL3-qR:CCTCATCACTGGATTATAG，如SEQIDNO.3所示。一种抗丛枝病泡桐的早期分子鉴定方法，包括下述步骤：(1)获取泡桐叶片：在同树龄泡桐样地，用高枝剪取待鉴定泡桐顶芽下部第一轮叶片；(2)泡桐RNA抽提：采用研磨法提取泡桐叶片RNA，并用分光光度计评估RNA样品的纯度和浓度，最后纯化RNA样品，并将RNA保存在-80℃以备后用；(3)合成cDNA：用SurescriptTMcDNA第一链合成试剂盒进行反转录反应，反应结束后，85℃灭活处理5min，-20℃保存反转录产物待用；(4)SPL3和miR156表达量测定：分别以GAPDH和U6为内参基因，利用Real-TimePCR方法和权利要求2所述引物测定SPL3和miR156的相对表达量；(5)表达量分析：参考SPL3和miR156的表达量，将高于SPL3的平均值、同时低于miR156的平均值的幼树认定为候选优株。经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术首次以SPL3和miR156基因在待测样本中的表达量作为鉴定抗从枝病泡桐的标准，在实际鉴定时，先采集泡桐叶片，利用PCR技术，测定泡桐SPL3和miR156的表达量；最后对阈值进行筛选，通过上述方法，缩短了育种时间，为抗丛枝病泡桐的选育提供了有力帮助。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。图1附图为SPL3基因的溶解曲线图；图2附图为miR156基因的溶解曲线图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术在对miR156和SPL3定量检测时，用到的引物为：实施例1一种抗从枝病泡桐的早期鉴定方法，包括下述步骤：(1)泡桐叶片获取：在一年生泡桐样地，对20株需要进行抗丛枝病选育的植株，用高枝剪取其顶芽下部第一轮叶片，放在做好标记的自封袋中，存放于装满干冰的采样箱中，回实验室后储存在-80℃冰箱；(2)RNA抽提1)样品处理取约80～100mg样品至冷冻研钵中，加入液氮研磨至粉末状，转移至装有1mLTrizol的1.5mL离心管中，振荡混匀后室温静置约5min；2)相分离每1mLTrizol加入0.2mL氯仿，振荡混匀15s后室温静置约3min，4℃，12000rpm，离心15min；3)沉淀转移水相至新的1.5mL离心管中，每1mLTrizol加入0.5mL异丙醇，混匀后室温静置10min，4℃，12000rpm，离心10min；4)洗涤弃上清，每1mLTrizol加入1mL75％的乙醇，混匀后4℃，7500rpm，离心5min；5)溶解弃上清，空气干燥RNA沉淀约5min(注意不要完全干燥，只需沉淀泛白即可)，加入适量的DEPC处理水溶解RNA沉淀；6)测定浓度和纯度用分光光度计测定RNA浓度和纯度后-80℃保存。(3)引物设计根据白花泡桐SPL3和miR156f-5p的碱基序列，利用BeaconDesigner软件设计引物，在引物设计过程中，首先引物与模板的序列紧密互补，无错配，避免出现发卡结构；引物长度通常在18-24bp，Tm值55-65℃，GC含量在40％-60％，在符合这些条件的基础上，选择Rating值最高的。(4)SPL3反转录1)解冻SurescriptTMFirst-StrandcDNASynthesisKit的试剂，上下轻柔颠倒混匀，短暂离心后放置冰上待用。2)冰上配制RNA-PrimerMix，在预冷的RNase-free反应管内加入以下表1的试剂至总体积13μL；表1试剂加入量TotalRNA...

【技术保护点】
1.SPL3和miR156基因在Real-Time PCR鉴定抗从枝病泡桐中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.SPL3和miR156基因在Real-TimePCR鉴定抗从枝病泡桐中的应用。


2.一种鉴定抗从枝病泡桐的引物，其特征在于，以SPL3和miR156基因进行鉴定，且所述引物序列如SEQIDNO.1～SEQIDNO.3所示；
miR156F-5P-qF：GACAGAAGATAGAGAGCACAA，如SEQIDNO.1所示；
miR156F-5P-qR：GeneCopoeia公司的All-in-OneTMmiRNAqRT-PCRDetectionKit试剂盒配有下游通用引物UniversalAdaptorPCRPrimer；
pau-SPL3-qF:TTCTGTCATCTAACTCTTG，如SEQIDNO.2所示；
pau-SPL3-qR:CCTCATCACTGGATTATAG，如SEQIDNO.3所示。


3....

【专利技术属性】
技术研发人员：范国强，翟晓巧，赵振利，王哲，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：河南;41