一种基于HRM的多DNA位点联合鉴定古巴光盖伞体系和方法技术

本发明专利技术提供了一种基于HRM的多DNA位点联合鉴定古巴光盖伞体系和方法，该体系包括用于鉴别古巴光盖伞的ITS、ITS1和ITS2、RPB1、tEF‑1α、PC‑PT和PC‑13的引物；与目前主要的致幻蘑菇鉴定方法相比，本发明专利技术基于HRM分析进行多DNA位点联合鉴定，具有省时、高效、特异性好、稳定性好和易于推广等优点。该方法使用Eva Green

【技术实现步骤摘要】
一种基于HRM的多DNA位点联合鉴定古巴光盖伞体系和方法
本专利技术涉及分子鉴定
，尤其涉及一种基于HRM的多DNA位点联合鉴定古巴光盖伞体系和方法。
技术介绍
古巴光盖伞(Psilocybecubensis)，是一种常见的致幻蘑菇，含有致幻型神经毒素，如赛洛西宾和赛络新等，属于我国规定管制的精神类毒品。因此，对古巴光盖伞等致幻蘑菇的鉴别是当前司法鉴定领域的重要任务和国际热点之一。在致幻蘑菇方面，我国已发现的含有裸盖菇素等致幻成分的蘑菇就有百余种，主要包括光盖菇属、斑褶伞属、锥盖伞属和裸伞属等。在中国云南等地，野生蘑菇资源丰富，常有当地居民误食含有精神活性物质的毒蘑菇而导致中毒的案件。这正是由于致幻蘑菇相似种属多，从外观上辨别困难，有毒种属和无毒种属外观差异不明显，不同发育阶段的致幻蘑菇形态存在差异，才导致了误食中毒事件的频频发生。再者，滥用者常常将致幻蘑菇做成干品或磨成粉末服用，外观破坏严重，很难通过肉眼辨别。每年都有因为误食有毒蘑菇中毒的案例，而患者往往缺乏对这些物种的识别能力，这也对医疗诊断系统造成了挑战。因此，需要有一种快速鉴别古巴光盖伞等致幻蘑菇的方法，获取物种信息，对症下药。DNA条形码技术(DNAbarcoding)是一种能够准确鉴定物种的技术手段，其主要通过对物种DNA序列中的部分片段进行测序分析以获取物种信息，达到物种种属鉴定的目的。当面对形态被严重破坏、高度降解的检材、被污染的混合物检材或是极其微量的样本，传统的毒物分析鉴定方法存在不稳定性，对法医学鉴定造成了困难。面对这种化学成分检测困难的样本，DNA条形码的鉴定存在极大的潜力，毒物的基因可以很稳定的存在于检材中，对毒物类型和来源的鉴别提供很好的选择。目前对古巴光盖伞等致幻蘑菇的鉴定主要依据DNA条形码ITS序列的鉴定，但获取的物种信息有限，分辨率较低，并且传统的基因测序等检测方法繁琐费时。因此，司法鉴定领域急需开发更多的适用于古巴光盖伞鉴定的DNA条形码，以及更快速、准确和易于操作推广的方法，以提高鉴定效能和分辨率，满足司法鉴定的需求。
技术实现思路
本专利技术针对以往利用形态学和毒物化学方法鉴别古巴光盖伞等致幻蘑菇不够准确的缺陷，提供了一种基于HRM的多DNA位点联合鉴定古巴光盖伞体系和方法，可以准确、稳定、快速地完成古巴光盖伞和一些常见致幻蘑菇种属的鉴定。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种基于HRM的多DNA位点联合鉴定古巴光盖伞体系，该体系包括用于鉴别古巴光盖伞的7个DNA位点的引物；该7个DNA位点包括5个DNA条形码和2个蛋白编码基因，具体包括ITS、ITS1和ITS2、RPB1、tEF-1α(translationelongationfactor1-α，简称PC-EF)、裸盖菇素相关的磷酸转移酶(psilocybin-relatedphosphotransferasegene)的编码基因(简称PC-PT)和3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde3-phosphatedehydrogenase)的编码基因(简称PC-13)。进一步地，ITS的扩增引物序列为SEQIDNO.2和SEQIDNO.3；ITS1的扩增引物序列为SEQIDNO.2和SEQIDNO.5；ITS2的扩增引物序列为SEQIDNO.7和SEQIDNO.3；RPB1的扩增引物序列为SEQIDNO.9和SEQIDNO.10；裸盖菇素相关的磷酸转移酶的编码基因的扩增引物序列为SEQIDNO.12和SEQIDNO.13；3-磷酸甘油醛脱氢酶的编码基因的扩增引物序列为SEQIDNO.15和SEQIDNO.16；tEF-1α的扩增引物序列为SEQIDNO.18和SEQIDNO.19。第二方面，本专利技术提供了一种采用上述体系的基于实时荧光PCR和HRM的多DNA位点联合鉴定古巴光盖伞的方法，包括如下步骤：步骤一，提取待测样本DNA；步骤二，利用上述引物对7个DNA位点分别进行实时荧光PCR扩增，得到扩增产物；步骤三，对待测样本DNA的扩增产物进行HRM分析并判断是否为古巴光盖伞。进一步地，判断的标准为：针对上述7个DNA位点，HRM曲线Tm值是否满足以下的全部条件：ITS：83.72±0.11℃，ITS1：80.98±0.16℃，ITS2：83.22±0.13℃，PC-R1：87.93±0.12℃，PC-PT：82.20±0.15℃，PC-13：79.73±0.15℃，PC-EF：80.10±0.25℃；若全部满足上述条件，待测样本是古巴光盖伞；若不满足其中任何一条，则待测样本不是古巴光盖伞。进一步地，上述实时荧光PCR扩增所采用的扩增体系包括：2×HRMPCRMasterMixPCR缓冲液，12.5μL；10μM正向和反向引物混合物，1.75μL；RNase-Free水，9.75μL；1ng/μL模板DNA溶液，1μL。进一步地，上述实时荧光PCR扩增所采用的扩增程序为：针对ITS，扩增程序为：95℃，预变性5分钟；95℃，变性10秒，55℃退火30秒，72℃延伸24秒，循环45次；针对ITS1、ITS2、PC-R1、PC-PT、PC-13和PC-EF，扩增程序为：95℃，预变性5分钟；95℃，变性10秒，55℃退火30秒，72℃延伸12秒，循环45次。进一步地，步骤三中先将扩增产物在65℃至95℃梯度升温环境中熔解，以0.1℃/2s增温，然后进行HRM分析。进一步地，上述HRM分析包括过ROTOR-GENEQSerious软件V2.1.0计算反应过程中采集到的荧光值的一阶导数(-dF/dT)，显示熔体温度峰值Tm，并以HRM曲线绘制表示。进一步地，上述方法采用了HRMTMPCRKit。进一步地，上述方法采用的HRM染料为EvaGreenTM。本专利技术采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：(1)对于最低62.5ng/μL的微量古巴光盖伞DNA样本有明显的鉴定效果；(2)可以确切区分除古巴光盖伞以外其他多种致幻蘑菇以及毒品原植物，如粪土生光盖伞、赭黄裸伞、大孢花褶伞和工业大麻等物种；(3)除去DNA提取环节，HRM分析仅需2小时，相较于传统化学毒物分析和分子生物分析方法，鉴定时间大大缩短；(4)提高了古巴光盖伞等毒品原植物的鉴定分辨率；(5)成本低，操作简单，高通量，一次可同时检测36个样本；(6)为物种分类提供新的数据类型，可以作为DNA条形码数据库构建的基础。与目前主要的致幻蘑菇鉴定方法相比，本专利技术基于HRM分析进行多DNA位点联合鉴定，具有省时、高效、特异性好、稳定性好和易于推广等优点。该方法使用的HRM新染料：EvaGreenTM，是一种饱和染料，降低了染料位置重组的可能，可准确的分析扩增产物中DNA的序列信息，生成特定HRM曲线和Tm值，作为物种特异性的标签。附图说明图1为本专利技术一实施例中古巴光盖伞的7个DNA位点HRM分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于HRM的多DNA位点联合鉴定古巴光盖伞体系，其特征在于，体系包括用于鉴别古巴光盖伞的7个DNA位点的引物；所述7个DNA位点包括5个DNA条形码和2个蛋白编码基因，具体包括ITS、ITS1和ITS2、RPB1、tEF-1α、裸盖菇素相关的磷酸转移酶的编码基因和3-磷酸甘油醛脱氢酶的编码基因。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于HRM的多DNA位点联合鉴定古巴光盖伞体系，其特征在于，体系包括用于鉴别古巴光盖伞的7个DNA位点的引物；所述7个DNA位点包括5个DNA条形码和2个蛋白编码基因，具体包括ITS、ITS1和ITS2、RPB1、tEF-1α、裸盖菇素相关的磷酸转移酶的编码基因和3-磷酸甘油醛脱氢酶的编码基因。


2.根据权利要求1所述的体系，其特征在于，ITS的扩增引物序列为SEQIDNO.2和SEQIDNO.3；ITS1的扩增引物序列为SEQIDNO.2和SEQIDNO.5；ITS2的扩增引物序列为SEQIDNO.7和SEQIDNO.3；RPB1的扩增引物序列为SEQIDNO.9和SEQIDNO.10；裸盖菇素相关的磷酸转移酶的编码基因的扩增引物序列为SEQIDNO.12和SEQIDNO.13；3-磷酸甘油醛脱氢酶的编码基因的扩增引物序列为SEQIDNO.15和SEQIDNO.16；tEF-1α的扩增引物序列为SEQIDNO.18和SEQIDNO.19。


3.一种采用如权利要求1或2所述体系的基于实时荧光PCR和HRM的多DNA位点联合鉴定古巴光盖伞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，提取待测样本DNA；
步骤二，利用所述引物对7个DNA位点分别进行实时荧光PCR扩增，得到扩增产物；
步骤三，对待测样本DNA的扩增产物进行HRM分析并判断是否为古巴光盖伞。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，判断的标准为：针对所述7个DNA位点，HRM曲线Tm值是否满足以下的全部条件：
ITS：83.72±0.11℃，ITS1：80.98±0.16℃，ITS2：83.22±0.13℃，RPB1：87.93±0.12℃，裸盖菇素相关的磷酸转移酶的编码基因：82.20...

【专利技术属性】
技术研发人员：张素华，李成涛，张晓春，夏若成，于欢，陶瑞旸，陈安琪，刘希玲，林源，阙庭志，赵珍敏，
申请(专利权)人：司法鉴定科学研究院，
类型：发明
国别省市：上海;31