【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物遗传学，具体涉及一种基于snv和indel甄别同卵双胞胎的鉴定方法。
技术介绍
1、同卵双胞胎是一个卵子与一个精子受精而产生的受精卵分裂的产物，理论上它们具有相同的遗传信息，因此，针对同卵双胞胎等复杂情况下的个体识别，使用传统的法医dna分型技术无法区分两者。
2、现有技术中，同卵双胞胎的鉴定主要包括三种方案：
3、第一种方案是：采集同卵双胞胎的外周血、口腔拭子、肠道活检样本等检材，利用传统的全基因组重亚硫酸盐甲基化测序技术获得全基因组dna甲基化水平图谱，进而利用生物信息数据分析技术获得差异甲基化区域。此外，西班牙学者在2018年利用pcr-高分辨率溶解技术在同卵双胞胎的唾液dna中发现了差异甲基化的cpg位点。该技术通过测量dna双链在升温过程中溶解的特性来检测dna序列变异，更适用于法医实验室。
4、第二种方案是：拷贝数变异(cnv)是指基因组上某些大片段的拷贝数增加或减少，可通过改变基因剂量和转录结构等来调节有机体的可塑性，是个体表型多样性和群体适应性进化的主要遗传基础之一。cnv是一种基因结构性变异，具有很强的多态性和相对不稳定性，其突变率比单碱基替换的突变率高100～10000倍。迄今为止，已有数支研究团队利用比较基因组杂交芯片或snp芯片技术结合birdsuite、penncnv、quantisnp等算法在同卵双胞胎的外周血、口腔上皮细胞dna中检测出体细胞cnv分型差异。
5、第三种方案是：线粒体dna(mtdna)与核dna相比，具有拷贝数高、基
6、然而，现有的上述任何一种技术方案在鉴定同卵双胞胎的实际应用中都存在一定的缺陷。具体而言，如果采用传统的全基因组重亚硫酸盐甲基化测序技术，那么通常需要亚硫酸氢盐处理或酶消化dna样本，这不仅耗费大量人力，而且还伴有dna损伤的风险。此外，越来越多的证据表明，由于环境或衰老等因素的影响，这种与同卵双胞胎相关的甲基化标识在其生命过程中可能会出现进化(即表观遗传漂移)。对于cnv而言，如果采用芯片技术检测同卵双胞胎的cnv分型差异，通常情况下，这种差异cnv数量极少且仅有极少量片段能通过qpcr验证。此外，如果采用mtdna来区分同卵双胞胎，由于mtdna是母系遗传，且不发生dna重组，因此，子代的mtdna基本上都是来自卵细胞，这一遗传排他性使得mtdna很难区分来自同一母体的同卵双胞胎。
7、因此，提供一种能够实现较低含量dna样本的检测、鉴定效能更高、更经济的同卵双胞胎甄别的鉴定方法具有重要意义。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种基于snv和indel甄别同卵双胞胎的鉴定方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
2、为了解决上述技术问题，本专利技术提供如下技术方案：
3、一种基于snv和indel甄别同卵双胞胎的鉴定方法：包括以下步骤：
4、s1：提取同卵双胞胎外周血中的dna，得样品dna；
5、s2：以样品dna制备小片段文库a，检测小片段文库a的文库浓度和片段大小；
6、s3：对s2获得的小片段文库a进行全基因组测序，得测序数据；
7、s4：全基因组测序数据处理，筛选出同卵双胞胎之间差异的snv和indel位点，以此为目的位点；
8、s5：设计步骤s4所述目的位点的特异性引物，经pcr扩增及纯化构建测序文库；
9、s6：多重pcr靶向重测序；
10、s7：靶向重测序数据分析，验证步骤s4所述的目的位点的真实性；
11、s8：对于步骤s7中验证失败或pcr产物大于350bp的目的位点，进行sanger测序。
12、优选地，s2具体包括以下步骤：
13、(一)先将样品dna片段化、进行末端修复和加a尾，筛选得到平末端dna片段；
14、(二)连接接头，得到加接头的dna片段；
15、(三)pcr扩增及纯化得到小片段文库，检测小片段文库的文库浓度和片段大小。
16、优选地，s4具体包括以下步骤：
17、(一)将原始测序数据进行质量控制，去掉低质量的reads，并与人类基因组序列进行比对；
18、(二)标记重复reads并进行碱基质量重校正；
19、(三)检测体细胞snv和indel，去掉位于已知基因组结构的变异位点，如：重复结构，拷贝数变异区域，富含多态性的长同源多聚物以及gc含量极高的dna序列；
20、(四)根据上步的过滤结果，进一步筛选出含有至少5个reads的snv和indel位点，以此为目的位点；
21、(五)使用annovar软件进行功能注释。
22、优选地，s5具体包括以下步骤：
23、(一)使用premier5软件设计目的位点的特异性引物，并使用琼脂糖凝胶电泳验证其特异性；
24、(二)将所有正向引物和反向引物以等浓度混合，形成单一正向引物混合物和单一反向引物混合物；
25、(三)扩增含有目的位点的片段，磁珠纯化扩增到的pcr产物，并将pcr产物进行末端修复，筛选得到平末端dna片段；
26、(四)连接接头，得到加接头的dna片段；
27、(五)对加接头的dna片段进行pcr扩增及纯化得到小片段文库b，检测小片段文库b的文库浓度和片段大小，稀释得测序文库。
28、优选地，所述单一正向引物混合物和单一反向引物混合物的浓度为10μm。
29、优选地，s5的步骤(五)中，检测小片段文库b的文库浓度和片段大小后，将文库稀释至8μm，得到最终的测序文库。
30、优选地，s7具体包括以下步骤：
31、(一)将原始测序数据由bcl格式转换成fastq格式；
32、(二)去除序列接头和3’端低质量的碱基；
33、(三)将处理好的测序数据比对到人类基因组上，进行基因组坐标排序，建立索引；
34、(四)对所有目的位点进行基因型分型。
35、优选地，s8具体包括以下步骤：
36、(一)取s7中验证失败或pcr产物大于350bp的位点，使用premier5软件设计特异性引物，并使用琼脂糖凝胶电泳验证其特异性；
37、(二)将所有正向引物和反向引物以等浓度混合，形成单一正向引物混合物和单一反向引物混合物；
38、(三)pcr反应扩增目的位点并进行纯化；
39、(四)取纯化后的产物进行sanger测序。
40、优选地，所述同卵双胞胎甄别的鉴定方法可应用于刑事案件侦破等司法领域。
41、与现有技术相本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于SNV和INDEL甄别同卵双胞胎的鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种基于SNV和INDEL甄别同卵双胞胎的鉴定方法，其特征在于：S2具体包括以下步骤：
3.根据权利要求1所述的一种基于SNV和INDEL甄别同卵双胞胎的鉴定方法，其特征在于：S4具体包括以下步骤：
4.根据权利要求1所述的一种基于SNV和INDEL甄别同卵双胞胎的鉴定方法，其特征在于：S5具体包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的一种基于SNV和INDEL甄别同卵双胞胎的鉴定方法，其特征在于：所述单一正向引物混合物和单一反向引物混合物的浓度为10μM。
6.根据权利要求4所述的一种基于SNV和INDEL甄别同卵双胞胎的鉴定方法，其特征在于：S5的步骤(五)中，检测小片段文库B的文库浓度和片段大小后，将文库稀释至8μM，得到最终的测序文库。
7.根据权利要求1所述的一种基于SNV和INDEL甄别同卵双胞胎的鉴定方法，其特征在于：S7具体包括以下步骤：
8.根据权利要求1所述的一种基于SNV
9.根据权利要求1～8所述的任意一种基于SNV和INDEL甄别同卵双胞胎的鉴定方法的应用，其特征在于：可用于司法领域。
...【技术特征摘要】
1.一种基于snv和indel甄别同卵双胞胎的鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种基于snv和indel甄别同卵双胞胎的鉴定方法，其特征在于：s2具体包括以下步骤：
3.根据权利要求1所述的一种基于snv和indel甄别同卵双胞胎的鉴定方法，其特征在于：s4具体包括以下步骤：
4.根据权利要求1所述的一种基于snv和indel甄别同卵双胞胎的鉴定方法，其特征在于：s5具体包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的一种基于snv和indel甄别同卵双胞胎的鉴定方法，其特征在于：所述单一正向引物混合物和单一反向引物混合物的...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘希玲，孙伟芬，王紫薇，韩丁丁，黄傲，冯旗，温姝博，李辉，姜磊，
申请(专利权)人：司法鉴定科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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