南松大小蠹的实时荧光PCR检测方法及检测用引物和探针技术

本发明专利技术提供了一种南松大小蠹的检测方法，经试验筛选的特异性引物(NS‑F和NS‑R)和探针(NS‑P)组合在Taq‑Man实时荧光定量PCR方法中可达到鉴定南松大小蠹的目的。本发明专利技术适用于不同状态大小蠹的检疫鉴定，弥补了常规形态学鉴定方法的不足，与现有技术中运用的DNA条形码鉴定技术相比，引物和MGB探针特异性强、灵敏度高、实验操作简单、用时短；鉴定结果直观，观察扩增曲线即可得出结果。本研究不但能满足进出境原本的快速通关的要求，提高检出率，同时能够有效预防危险性大小蠹的入侵和扩散，对保护我国农林业生产和生态安全具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
南松大小蠹的实时荧光PCR检测方法及检测用引物和探针
本专利技术属于生物物种分子鉴定
，涉及一种大小蠹的实时荧光PCR检测方法，具体涉及南松大小蠹的实时荧光PCR检测方法及其应用；此外，本专利技术还涉及检测南松大小蠹的引物和探针。
技术介绍
大小蠹属Dendroctonus隶属于鞘翅目Coleoptera、象甲科Curculionidae、小蠹亚科Scolytinae，是一类重要的森林生态系统蛀干害虫，其主要对松属、云杉属、黄杉属等林木造成危害，该属(非中国种)已被列入我国进境植物检疫性有害生物名录。全世界大小蠹属已知共20种，其中中、北美洲分布18种，欧洲、亚洲现分布3种。大小蠹属非中国种害虫南松大小蠹Dendroctonusfrontalis原产于美国，不仅是危害松类针叶树种的蛀干害虫，而且传播蓝霉菌，破坏传播水分的木质部，造成树木死亡。研究结果表明，南松大小蠹在我国可能适宜定殖的地区范围较广，包括安徽中北部、湖北中北部、四川部分地区、云南部分地区、山西南部等。随着我国对外贸易的日益频繁，进口木材数量与日俱增，口岸截获的害虫种类和数量不断增加，故对其进行快速准确的检疫鉴定对预防检疫性种类入侵有重要的意义。目前针对大小蠹属种类，基于外部形态特征进行鉴定仍是检疫系统最常用的方法。然而，形态学鉴定主要以成虫为研究对象，口岸截获的大小蠹中有相当一部分为幼虫，蛹或者部分破碎的成虫，使得形态学鉴定难以实现准确鉴定。不仅如此，大小蠹属害虫的种间形态相似，差异较小，鉴定较为困难，对鉴定人员经验和分类基础要求较高。因此，探索新的方法弥补形态鉴定的不足显得尤为重要和迫切。近年来，随着分子生物学技术的不断发展，如DNA条形码技术、常规PCR检测技术、实时荧光定量PCR检测技术、限制性片段长度多态性(RFLP)技术及微卫星技术等多种技术逐渐应用于物种的分子鉴定方法当中。但国内对于大小蠹的分子鉴定技术研究报道仍旧较少，殷玉生等基于线粒体COI基因对我国口岸经常截获的6种大小蠹属昆虫快速鉴定的可行性和准确性进行了研究(详见：殷玉生，张帆，安榆林.基于线粒体COI基因鉴定大小蠹属昆虫[J].福建林业科技，2014，41(01)：63-67.)；花婧等通过线粒体COI基因867bp片段序列对大小蠹属17个种类进行序列分析，表明COI基因可作为大小蠹属昆虫分类的依据(详见：花婧，郑斯竹，安榆林，杨晓军.基于线粒体COⅠ基因的大小蠹属昆虫DNA条形码研究[J].江苏农业科学，2014，42(03)：30-32.)；田虎等基于DNA条形码技术表明mtDNACOI基因5'端和3'端序列均可有效区分红翅大小蠹与黑脂大小蠹(详见：田虎，于培文，娄巧哲，徐志彬，杨晓丽，王新军，郝常，郭扬振.基于DNA条形码的红翅大小蠹和黑脂大小蠹分子鉴定[J].植物检疫，2020，34(01)：30-34.)。但目前大小蠹分子鉴定尚未进行实时荧光PCR快速鉴定技术研究。实时荧光定量PCR是在PCR技术基础上发展起来的一种高度灵敏的核酸定量技术，因其技术具有准确、特异、灵敏和快速等优点，在近几年已被广泛应用于生物学、医学、农业、食品、环保等多个领域中。在昆虫检疫领域该方法也得到了广泛地应用，如陈岩等根据火蚁属COI基因序列，设计了对红火蚁具有特异性的引物与TaqMan探针，可对不同虫态的红火蚁进行鉴定(详见：陈岩，陈乃中，朱水芳，陈洪俊.红火蚁实时荧光分子检测方法[J].植物检疫，2005(04)：204-206.)；Feng等根据三叶草斑潜蝇的保守区序列设计了1对引物与特异性TaqMan探针并建立了三叶草斑潜蝇实时荧光定量PCR鉴定体系，可以准确鉴定各种虫态的三叶草斑潜蝇(详见：XianFeng，ChenNai-Zhong，MaJun，ZhuShui-fang，HuXue-nan.MolecularidentificationofLiriomyzatrifolii(Burgess)(Dipt.,Agromyzidae)basedonreal-timePCR[J].JournalofAppliedEntomology，2007，131(8).)；姜帆基于DNA条形码序列，设计并筛选出27种我国主要检疫性实蝇种特异性引物和特异性TaqMan-MGB探针(详见：姜帆.我国检疫性实蝇分子鉴定技术体系的研究[D].中国农业大学，2015.)；徐浪等应用TaqMan实时荧光PCR方法实现了对新菠萝灰粉蚧和菠萝灰粉蚧进行快速准确鉴定(详见：徐浪，林伟，黄蓬英，张伟锋，卢小雨，汪莹，郑耘，焦懿，娄定风，余道坚.应用TaqManMGB探针快速检测新菠萝灰粉蚧和菠萝灰粉蚧[J].植物检疫，2016，30(04)：38-41.)。本专利技术人以南松大小蠹为研究对象，选取口岸经常截获的同属大小蠹害虫如黑脂大小蠹D.terebrans、红脂大小蠹D.valens、红翅大小蠹D.rufipennis、华山松大小蠹D.armandi、黄杉大小蠹D.pseudotsugae及另一小蠹科昆虫钝贵小蠹Gnathotrichusretusus作为对照，根据mtDNACOI基因序列设计特异性引物对和TaqMan探针，利用TaqMan实时荧光PCR技术建立了针对南松大小蠹的分子鉴定技术，得到了本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种快速、准确的鉴定南松大小蠹的方法，为木材有害生物的检疫提供便利。基于上述目的，本专利技术提供了一种南松大小蠹的检测方法，具体包括，(1)设计引物和探针；该引物和探针的序列为：上游引物NS-F序列为：5'-AGCCTTATTGTTCGAACG-3'；下游引物NS-R序列为：5'-GGCTCCTAATATTAGAGGAAC-3'；探针引物NS-P序列为：5'-AACTCCAGGCAGACT-3'；所述探针引物的5'端连接荧光基团FAM，3'端连接非荧光猝灭基团。(2)提取南松大小蠹基因组DNA；(3)采用步骤(1)中引物和探针进行实时荧光PCR检测，根据扩增曲线区分南松大小蠹和其他检疫性大小蠹昆虫。作为本专利技术优选的技术方法，步骤(2)具体实施方法为：取供试南松大小蠹标本足或头胸部肌肉组织，进行基因组DNA的提取。作为本专利技术优选的技术方法，步骤(3)所述实时荧光PCR检测方法反应体系组分包括：PremixExTaq(ProbeqPCR)(2×)10μL、上游引物NS-F(10μM)0.4μL、下游引物NS-R(10μM)0.4μL、探针NS-P(10μM)0.8μL、ROXReferenceDyeII(50×)0.2μL、DNA模板2μL、灭菌水6.2μL。作为本专利技术优选的技术方法，步骤(3)所述实时荧光PCR检测方法反应程序为：95℃预变性30sec，95℃变性5sec，56℃退火30sec，变性-退火两个过程重复35个循环。本专利技术采用的实时荧光PCR检测方法采用Taq-ManMGB探针。Taq-ManMGB探针是在普通Taq-Man探针基础上发展起来的一种新型探针，其与本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.南松大小蠹的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)设计引物和探针；/n(2)提取南松大小蠹基因组DNA；/n(3)采用步骤(1)中引物进行实时荧光PCR检测，根据结果区分南松大小蠹和其他检疫性大小蠹昆虫。/n

【技术特征摘要】
1.南松大小蠹的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)设计引物和探针；
(2)提取南松大小蠹基因组DNA；
(3)采用步骤(1)中引物进行实时荧光PCR检测，根据结果区分南松大小蠹和其他检疫性大小蠹昆虫。


2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)所述的引物包括上游引物和下游引物，
所述上游引物NS-F序列为：5'-AGCCTTATTGTTCGAACG-3'；
所述下游引物NS-R序列为：5'-GGCTCCTAATATTAGAGGAAC-3'。


3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)所述探针的引物NS-P序列为：5'-AACTCCAGGCAGACT-3'。


4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述探针引物的5'端连接荧光基团FAM，3'端连接非荧光猝灭基团。


5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)的具体实施方法为：取供试南松大小蠹标本足或头胸部肌肉组织，进行基因组DNA的提取。


6.根据权利要求1所述的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，步骤(3)所述实时荧光PCR检测方法的反应体系组分包括：PremixExTaq(Pro...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟瑞，蔡波，刘嘉欢，敖苏，徐卫，刘福秀，韩玉春，陈施明，王安石，
申请(专利权)人：海口海关热带植物隔离检疫中心，
类型：发明
国别省市：海南;46