用于检测少花蒺藜草的引物探针、试剂盒和实时荧光定量PCR检测方法技术

技术编号：41088241 阅读：3 留言：0更新日期：2024-04-25 13:49

本发明专利技术提供了一种用于检测少花蒺藜草的引物探针、试剂盒和实时荧光定量PCR检测方法，属于生物物种鉴定技术领域。根据少花蒺藜草基因组序列的特异靶标序列设计特异性引物(CS‑F和CS‑R)和探针(CS‑P)，建立了检测少花蒺藜草的引物探针、试剂盒和实时荧光定量PCR检测方法，可以有效地区分少花蒺藜草及其近似种。采用本发明专利技术的荧光定量PCR检测方法，具有特异性强，灵敏度高的特点，可实现对少花蒺藜草的快速、准确地鉴定溯源，且扩增效率高，解决了容易出现假阳性扩增的技术难题。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物物种鉴定，具体涉及一种用于检测少花蒺藜草的引物探针、试剂盒和实时荧光定量pcr检测方法。

技术介绍

1、少花蒺藜草(cenchrus spinifex)为一年生草本植物，原产于北美洲和热带的沿海地区。少花蒺藜草入侵性和抗逆性极强，种子繁殖率高，在恶劣的环境条件下也能结实，萌发形成植株，给生态系统造成了严重的破坏。随着我国经济的快速发展，粮食贸易和种质资源交流更加频繁，植物检疫任务愈加繁重。

2、目前，国内外对杂草的鉴定主要通过形态学特征进行观察分析，但仅依靠形态学鉴定很难做出准确的鉴定，特别是植物发育不完全或只有部分植株材料，经过加工处理后杂草的原有性状特征均已消失，难于通过性状鉴定的方法进行有效鉴定。而蒺藜草属植物种类繁多，种间仅凭形态特征较难分辨，同时地理分布较近的种类分子水平差异较小，因此设计出具有特异性的taq-man实时荧光定量pcr的引物和探针，是本领域亟需解决的技术难题。

技术实现思路

1、本专利技术的目的是提供一种用于检测少花蒺藜草的引物探针、试剂盒和实时荧光定量pcr检测方法，该检测方法解决了少花蒺藜草近似种基因序列差异较小，少花蒺藜草特异片段定位困难，容易出现假阳性扩增的技术难题，从而快速准确地检测鉴定少花蒺藜草。

2、为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为：本专利技术提供了一种用于检测少花蒺藜草的引物和探针，引物序列为：

3、上游引物cs-f：5'-cgtatcacctaccaataacc-3'(seq id no.1)；

4、下游引物cs-r：5'-gaacttcaccaacatctcat-3'(seq id no.2)。

5、探针序列cs-p：5'-acgcgctgtctgtgt-3'(seq id no.3)。

6、具体的，本专利技术提供了一种用于检测少花蒺藜草的试剂盒，该试剂盒包括序列seqid no.1和seq id no.2所示的引物，以及序列seq id no.3所示探针。

7、具体的，本专利技术还提供了一种少花蒺藜草的实时荧光定量pcr检测方法，包括以下步骤：(1)提取待检植物样品dna；(2)seq id no.1和seq id no.2所示的引物、seq id no.3所示的探针对样品dna进行实时荧光定量pcr检测。

8、进一步，少花蒺藜草的实时荧光定量pcr检测方法的反应体系为25μl，包括2×premix ex taq 12.5μl、浓度为10μmol/l的上游引物cs-f 0.5μl、浓度为10μmol/l的下游引物cs-r 0.5μl、浓度为10μmol/l的探针cs-p 0.5μl、50×rox reference dye 0.5μl、dna模板2μl、ddh2o 8.5μl。

9、进一步，少花蒺藜草的实时荧光定量pcr检测方法的反应程序包括：预变性95℃10min；95℃15sec，60℃1min，循环40次。

10、具体的，本专利技术还公开了seq id no.1和seq id no.2所示的引物、seq id no.3所示的探针及实时荧光定量pcr检测方法在检测少花蒺藜草中的应用。

11、通过实施本专利技术的技术方案，可以达到以下有益效果：

12、(1)通过测定蒺藜草的基因组序列，序列比对分析少花蒺藜草及其近似种的差异位点，根据少花蒺藜草基因组序列的特异靶标序列设计的特异性引物和探针，可以有效地区分少花蒺藜草及其近似种。

13、(2)采用本专利技术的荧光定量pcr检测方法，具有特异性强，灵敏度高的特点，可实现对少花蒺藜草实施快速、准确地鉴定溯源，且扩增效率高，解决了容易出现假阳性扩增的技术难题。

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【技术保护点】

1.一种用于检测少花蒺藜草的引物和探针，其特征在于，所述引物序列为：

2.一种用于检测少花蒺藜草的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的引物和探针。

3.一种少花蒺藜草的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的少花蒺藜草的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR检测方法的反应体系为25μL，包括2×Premix Ex Taq 12.5μL、浓度为10μmol/L的上游引物CS-F 0.5μL、浓度为10μmol/L的下游引物CS-R 0.5μL、浓度为10μmol/L的探针CS-P 0.5μL、50×ROX Reference Dye 0.5μL、DNA模板2μL、ddH2O 8.5μL。

5.根据权利要求3所述的少花蒺藜草的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR检测方法的反应程序包括：预变性95℃10min；95℃15sec，60℃1min，循环40次。

6.权利要求1所述的引物和探针、权利要求2所述的试剂盒、权利要求3-5任一项所

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【技术特征摘要】

1.一种用于检测少花蒺藜草的引物和探针，其特征在于，所述引物序列为：

2.一种用于检测少花蒺藜草的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的引物和探针。

3.一种少花蒺藜草的实时荧光定量pcr检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的少花蒺藜草的实时荧光定量pcr检测方法，其特征在于，所述实时荧光定量pcr检测方法的反应体系为25μl，包括2×premix ex taq 12.5μl、浓度为10μmol/l的上游引物cs-f 0.5μl、浓度为10μmol/l的下游引...

【专利技术属性】
技术研发人员：李佳潼，潘英文，陈林军，刘福秀，王安石，陈施明，
申请(专利权)人：海口海关热带植物隔离检疫中心，
类型：发明
国别省市：

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