矮柱兰实时荧光定量PCR检测方法及检测试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种矮柱兰的实时荧光定量PCR检测方法及检测试剂盒，根据矮柱兰核糖体基因ITS的特异靶标序列设计特异性引物（TP

【技术实现步骤摘要】
矮柱兰实时荧光定量PCR检测方法及检测试剂盒


[0001]本专利技术属于生物物种鉴定
，具体涉及一种矮柱兰实时荧光定量PCR检测方法及检测试剂盒。

技术介绍

[0002]矮柱兰（Thelasis pygmaea）隶属兰科兰亚科树兰族矮柱兰属，具有较高的园艺价值和保护生物学价值。实时荧光定量PCR用于检测鉴定生物物种要符合特定引物探针设计要求，尤其要找到区别于其他近似种的特异引物和探针位点，探针选择不好会有假阳性扩增。目前没有矮柱兰的实时荧光定量PCR检测鉴定相关的专利文献和非专利文献公开。本专利技术针对濒危兰科植物矮柱兰进行鉴定区分。
[0003]目前，国内外对物种资源的检测鉴定主要通过植物形态学进行观察分析，仅仅依靠形态学鉴定往往很难做出准确的检测，特别是在植物发育不完全或只有部分植株材料的时候。兰科植物种类繁多，地理分布较近的种类分子水平的差异较小，设计出具有特异性的Taq
‑
Man实时荧光定量PCR引物和探针，是本领域亟需解决的技术难题。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种矮柱兰实时荧光定量PCR检测方法，该检测方法解决了矮柱兰近似种基因序列差异较小，矮柱兰特异片段定位困难，容易出现假阳性扩增的技术难题，从而快速准确地检测鉴定矮柱兰。
[0005]为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种矮柱兰实时荧光定量PCR检测方法，提取待检植物样品DNA，利用引物和探针进行实时荧光定量PCR检测鉴定矮柱兰。
[0006]具体的，所述引物包含上游引物TP
‑
F与下游引物TP
‑
R，其序列为：上游引物TP
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F:5'
‑
AACACCTGAGCCTCGTAATG
‑
3'；下游引物TP
‑
R:5'
‑
ATTCTACGCATCCGAACCTC
‑
3'。
[0007]具体的，所述探针TP
‑
P序列为：TP
‑
P:5'
‑
ATCCGTCTCGCCAG
‑
3'，荧光基团连接在探针的5'末端，淬灭基团连接在3'末端。
[0008]具体的，所述实时荧光定量PCR检测的反应体系为25μL，包括2
×
Premix Ex Taq（Probe qPCR）12.5μL、上游引物TP
‑
F（10μmol/L） 0.5μL、下游引物TP
‑
R（10μmol/L）0.5μL、探针TP
‑
P（10μmol/L）0.5μL、50
×
ROX Reference Dye 0.5μL、DNA模板2μL、ddH2O 8.5μL。
[0009]具体的，所述实时荧光定量PCR检测方法的反应程序包括：预变性95℃10min；95℃15sec，60℃1min，循环40次。
[0010]本专利技术还提供了一种用于实时荧光定量PCR检测矮柱兰的试剂盒，该检测试剂盒包括：上游引物TP
‑
F，下游引物TP
‑
R，探针TP
‑
P。
[0011]具体的，所述上游引物TP
‑
F序列为：5'
‑
AACACCTGAGCCTCGTAATG
‑
3'；所述下游引物TP
‑
R序列为：5'
‑
ATTCTACGCATCCGAACCTC
‑
3'；
所述探针TP
‑
P序列为：5'
‑
ATCCGTCTCGCCAG
‑
3'，荧光基团连接在探针的5'末端，淬灭基团连接在3'末端。
[0012]通过实施本专利技术的技术方案，可以达到以下有益效果：（1）通过测定兰科植物的核糖体基因ITS序列，序列比对分析矮柱兰及其近似种的差异位点，根据矮柱兰核糖体基因ITS序列的特异靶标序列设计特异性引物和探针，可以有效地区分矮柱兰及其近似种。
[0013]（2）可实现在核酸浓度较低的情况下对矮柱兰的检测，检测的最低DNA浓度可达1
×
10
﹣2 ng/μL。
[0014]（3）可实现用一对引物、一个探针在一个反应内对矮柱兰实施快速、精准地鉴定溯源，且扩增效率高，解决了容易出现假阳性扩增的技术难题。
附图说明
[0015]图1为本专利技术中特异性引物TP
‑
F/TP
‑
R和探针TP
‑
P在矮柱兰核糖体ITS基因上的位置示意图。
[0016]图2为矮柱兰实时荧光定量PCR检测引物TP
‑
F/TP
‑
R和探针TP
‑
P组合的实时荧光定量PCR特异性检测结果。其中，A为矮柱兰Thelasis pygmaea、B为滇南矮柱兰Thelasis khasiana、C为馥兰Phreatia formosana、D为苞舌兰Spathoglottis pubescens、E为铃花黄兰Cephalantheropsis calanthoides、F为三棱虾脊兰Calanthe tricarinata、G为美冠兰Eulophia graminea、H为ddH2O。
[0017]图3为矮柱兰实时荧光定量PCR检测方法灵敏度检测结果。其中，A、B、C、D、E、F对应的DNA模板浓度分别为100 ng/μL、10 ng/μL、1 ng/μL、1
×
10
‑
1 ng/μL、1
×
10
‑
2 ng/μL、1
×
10
‑
3 ng/μL，G为ddH2O。
具体实施方式
[0018]下面将对本专利技术实施例中的技术方案清楚、完整地进行描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0019]实施例1本实施例设计并合成了所述矮柱兰的检测方法所用的特异性引物和探针。
[0020]通过测定兰科植物的核糖体基因ITS序列，以及GenBank DNA序列数据库进行比对分析，确定矮柱兰及其近似种的差异位点。利用MEGA6.0软件，根据比对结果人工寻找矮柱兰的特异性位点并在特异性位点上下游设计特异性引物。利用Primer Premier5.0软件检查设计好的引物是否存在错配、二聚体和发夹结构，并用NCBI中提供的Blast程序检查是否存在同源序列。随后在矮柱兰的特异性引物范围内（包括引物序列），人工寻找能与其他物种区分开的差异位点；结合Taq
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Man探针设计原则，通过Primer Express 3.0软件(Applie本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种矮柱兰的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，提取待检植物样品DNA，利用引物和探针进行实时荧光定量PCR检测鉴定矮柱兰；所述引物包含上游引物TP
‑
F与下游引物TP
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R，其序列为：TP
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F:5'
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AACACCTGAGCCTCGTAATG
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3'，TP
‑
R:5'
‑
ATTCTACGCATCCGAACCTC
‑
3'。所述探针的序列为：TP
‑
P:5'
‑
ATCCGTCTCGCCAG
‑
3'，荧光基团连接在探针的5'末端，淬灭基团连接在3'末端。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，实时荧光定量PCR检测反应体系为25μL，包括2
×
Premix Ex Taq（Probe qPCR）12.5μL、上游引物TP
‑
F 0.5μL、下游引物TP
‑
R 0.5μL、探针TP
‑
P 0.5μL、50
×
ROX Reference Dye 0.5μL、DNA模板2μL、ddH2O ...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘英文，李佳潼，刘福秀，谢添伟，王安石，陈施明，韩松，
申请(专利权)人：海口海关热带植物隔离检疫中心，
类型：发明
国别省市：