一种志贺菌属核酸分子的检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种志贺菌属核酸分子的检测方法，其包括利用Argonaute蛋白的特性，初级向导ssDNAs介导Argonaute蛋白剪切靶标DNA后，断裂产生的次级向导ssDNA再次被Argonaute蛋白利用去剪切与次级向导ssDNA互补的荧光报告核酸；靶标DNA的序列如SEQ ID NO.1所示。检测结果表明，该检测方法在现有技术的基础上有更好的灵敏性和重复性。好的灵敏性和重复性。好的灵敏性和重复性。

【技术实现步骤摘要】
一种志贺菌属核酸分子的检测方法及试剂盒


[0001]本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种志贺菌属核酸分子的检测方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]Argonaute(Ago)蛋白质是一种可编程核酸酶,广泛分布于真核生物和原核生物。真核生物Ago蛋白质在RNA干扰途径中起关键作用,能够在小RNA或者小DNA的引导下识别甚至切割与之互补的RNA。原核生物Ago蛋白质可能参与宿主防御和DNA复制,偏爱在小DNA的引导下切割与之互补的DNA。基于这些特性，Ago蛋白质能够在核酸检测和遗传操作等方面得以应用。
[0003]慢性便秘(CC)是一种常见的多因素疾病，其特征是排便减少、大便硬和大便过度紧张。一些慢性便秘患者可以治愈，然而大约三分之一的慢性转移性功能性便秘患者(FC)对治疗没有反应并反复发作，这种医学上难治性慢运输型便秘被认为是结肠切除术的并发症(STC)，而这种病又称为对常规药物无效的顽固性功能性便秘(IFC)。到目前为止，已经确定了与难治性慢运输型便秘相关的几个因素，特别是，最近的全基因组分析和粪便移植表明，肠道微生物志贺菌属(Shigella sp.variant)可能是影响肠道转运和慢性便秘表型的重要因素。
[0004]人体肠道中存在的数量庞大的微生物，这群微生物依靠人体的肠道生活，同时帮助人体完成多种生理生化功能。肠道微生物不仅在膳食和宿主之间起到了重要的桥梁作用，其本身以及代谢产物也能调节人体健康，因此肠道微生物与人体健康密切相关。因此，基于原核Argonaute蛋白开发一种灵敏度高、特异性好、快速高效的志贺菌属核酸检测方法是非常有必要的。
[0005]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种用于检测志贺菌属核酸分子的方法及试剂盒，以提高志贺菌属核酸分子的检测灵敏度。
[0007]本专利技术是这样实现的：
[0008]本专利技术提供了一种志贺菌属核酸分子的检测方法，其包括利用Argonaute蛋白的特性，初级向导ssDNAs介导Argonaute蛋白剪切靶标DNA后，断裂产生的次级向导ssDNA再次被Argonaute蛋白利用去剪切与次级向导ssDNA互补的荧光报告核酸；
[0009]上述靶标DNA的序列如SEQ ID NO.1所示。
[0010]在一些实施方式中，Argonaute蛋白是以DNA为向导指导剪切靶标DNA的中等温度Argonaute蛋白。
[0011]在一些实施方式中，中等温度Argonaute蛋白包括BlAgo酶。
[0012]在一些实施方式中，BlAgo酶的工作温度为36
‑
38℃。
[0013]在一些实施方式中，靶标DNA在检测体系中的浓度为≥1拷贝/微升。
[0014]在一些实施方式中，靶标DNA在检测体系中的浓度为≥4拷贝/微升。
[0015]在一些实施方式中，靶标DNA在检测体系中的浓度为≥10拷贝/微升。
[0016]在一些实施方式中，初级向导ssDNAs与靶标DNA互补配对，其包括初级向导ssDNA A链和初级向导ssDNA B链。
[0017]初级向导ssDNA A链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
[0018]初级向导ssDNA B链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0019]在一些实施方式中，初级向导ssDNAs为5
’‑
磷酸化的单链DNA分子。
[0020]在一些实施方式中，初级向导ssDNAs的长度为18
‑
25nt。
[0021]在一些实施方式中，靶标DNA和Argonaute蛋白与初级向导ssDNAs在检测体系中的摩尔比为8:60:1
‑
40:600:1。
[0022]在一些实施方式中，次级向导ssDNA的长度为10
‑
25nt。
[0023]在一些实施方式中，荧光报告核酸的长度为25
‑
50nt。
[0024]在一些实施方式中，荧光报告核酸在检测体系中的浓度为200
‑
1000nM。
[0025]在一些实施方式中，靶标DNA与荧光报告核酸的摩尔比为：102：1至2
×
105：1；优选地，靶标DNA与荧光报告核酸的摩尔比102：1至2
×
103：1。
[0026]本专利技术还提供了一种用于检测志贺菌属核酸分子的试剂盒，其包括上述方法中采用的Argonaute蛋白、初级向导ssDNAs和荧光报告核酸。
[0027]本专利技术具有以下有益效果：
[0028]本专利技术利用以DNA为向导指导剪切靶标DNA的Argonaute蛋白的特性：即在首次由初级向导ssDNA(guide ssDNA)介导剪切后，在合适的反应温度下，断裂的5
’
核酸片段可再次被Argonaute蛋白利用去剪切与之互补的荧光报告核酸链，通过荧光报告核酸断裂产生的荧光信号检测样本中志贺菌属核酸含量。检测结果表明，该检测方法在现有技术的基础上有更好的灵敏性和重复性。
附图说明
[0029]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0030]图1为实验例中两种方法的检测结果对比：A为RT
‑
qPCR试剂盒分别对反应体系中0拷贝至1000拷贝靶基因的检测结果，数据来自九次重复实验；B为BlAgo介导的核酸检测方法分别对反应体系中0拷贝至1000拷贝靶基因的检测结果，数据来自九次重复实验。
具体实施方式
[0031]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0032]Argonautes是一种核酸酶，其普遍存在于细菌、植物、真菌、哺乳细胞内。其除了参与RNA干扰机制，某些物种的Argonaute还可作为DNA核酸内切酶。
[0033]中等温度Argonaute蛋白(Ago酶)包括Brevibacillus laterosporus(BlAgo)、Clostridiumbutyricum(CbAgo)、Intestinibacter bartlettii(IbAgo)及其突变体，通过CbAgo的系统进化树分析，我们从嗜温细菌中发现了Brevibacillus laterosporus(BlAgo)，并研究了它们在广泛条件下切割ssDNA和dsDNA的生化特性。其中BlAgo酶切特性为：该酶能够在中等温度条件下利用5
’
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种志贺菌属核酸分子的检测方法，其特征在于，包括利用Argonaute蛋白的特性，初级向导ssDNAs介导Argonaute蛋白剪切靶标DNA后，断裂产生的次级向导ssDNA再次被Argonaute蛋白利用去剪切与次级向导ssDNA互补的荧光报告核酸；所述靶标DNA的序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述Argonaute蛋白是以DNA为向导指导剪切靶标DNA的中等温度Argonaute蛋白；优选地，所述中等温度Argonaute蛋白包括BlAgo酶；优选地，所述BlAgo酶的工作温度为36
‑
38℃。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述靶标DNA在检测体系中的浓度为≥1拷贝/微升；优选地，所述靶标DNA在检测体系中的浓度为≥4拷贝/微升。4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述初级向导ssDNAs与靶标DNA互补配对，其包括初级向导ssDNA A链和初级向导ssDNAB链；所述初级向导ssDNAA链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述初级向导ssDNA B链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述初...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈鹤霄，李国龙，吕永玲，张帆，任泉，方凯，
申请(专利权)人：美益添生物医药武汉有限公司，
类型：发明
国别省市：