本发明专利技术公开了一种高突变率的易错PCR技术的建立与应用，属于PCR技术领域，一种高突变率的易错PCR技术的建立与应用，包括配制mix、设计引物、建立体系，扩增PCR、验证产物、回收产物、连接转化、阳性筛选、菌液测序，可以实现通过高突变率的易错PCR技术对基因文库的构建、快速获得优质基因、对特定基因进行定向进化，通过配制易错PCR反应mix，在针对不同的基因设计引物，且片段大小不同，随后建立易错PCR反应体系，将配制好的易错PCR反应体系放入PCR扩增仪中进行易错PCR扩增，利用琼脂糖凝胶电泳验证易错PCR产物，在胶回收得到纯化的易错PCR产物，从而进行连接、转化，阳性克隆筛选，菌液送测序，不仅操作简便，同时得到的PCR产物产量高、变异水平高。变异水平高。变异水平高。
【技术实现步骤摘要】
一种高突变率的易错PCR技术的建立与应用
[0001]本专利技术涉及PCR
，更具体地说，涉及一种高突变率的易错PCR技术的建立与应用。
技术介绍
[0002]聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。
[0003]PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物，PCR由变性
‑‑
退火
‑‑
延伸三个基本反应步骤构成：
①
模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
②
模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
③
引物的延伸：DNA模板
‑‑
引物结合物在72℃、DNA聚合酶(如TaqDNA聚合酶)的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性
‑‑
退火
‑‑
延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
[0004]然而现有PCR技术在操作方面较为麻烦，不够便捷，得到的PCR产物产量不够高，变异水平同样也不高，从而不能快速获得优质的基因，因此目前需要一种高突变率的易错PCR技术的建立加以应用。
技术实现思路
[0005]1.要解决的技术问题
[0006]针对现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种高突变率的易错PCR技术的建立与应用，可以实现通过高突变率的易错PCR技术对基因文库的构建、快速获得优质基因、对特定基因进行定向进化，通过配制易错PCR反应mix，在针对不同的基因设计引物，且片段大小不同，随后建立易错PCR反应体系，将配制好的易错PCR反应体系放入PCR扩增仪中进行易错PCR扩增，利用琼脂糖凝胶电泳验证易错PCR产物，在胶回收得到纯化的易错PCR产物，从而进行连接、转化，阳性克隆筛选，菌液送测序，不仅操作简便，同时得到的PCR产物产量高、变异水平高。
[0007]2.技术方案
[0008]为解决上述问题，本专利技术采用如下的技术方案。
[0009]一种高突变率的易错PCR技术的建立与应用，包括以下步骤：
[0010]S1.配制易错PCR反应mix，以及10X氯化锰溶液；
[0011]S2.针对两个基因分别设计引物；
[0012]S3.建立易错PCR反应体系；
[0013]S4.将配制好的易错PCR反应体系放入PCR扩增仪中进行易错PCR扩增；
[0014]S5.扩增得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳，全部上样，验证条带大小是否正确。
[0015]S6.琼脂糖凝胶回收得到纯化的易错PCR产物；
[0016]S7.进行载体连接、转化；
[0017]S8.筛选阳性克隆，取菌液送测序；
[0018]通过高突变率的易错PCR技术对基因文库的构建、快速获得优质基因、对特定基因进行定向进化，不仅操作简便，同时得到的PCR产物产量高、变异水平高。
[0019]进一步的，所述步骤S1中易错PCR反应mix分别包括Taq DNA聚合酶：200
‑
500U/ml，dATP(100Mm)：3
‑
8μl/ml；dTTP(100Mm)：15
‑
20μl/ml；dGTP(100Mm)：3
‑
8μl/ml；dCTP(100Mm)：15
‑
20μl/ml；氯化镁：5
‑
10mM；氯化钾：200
‑
500mM；Tris：40
‑
100mM，所述10
×
氯化锰溶液为3
‑
10mM。
[0020]进一步的，所述步骤S2中两个基因分别为基因A片段大小为：1kb，基因B片段大小为：423bp。
[0021]进一步的，所述步骤S3中易错PCR反应体系试剂及用量分别包括：扩增模板试剂(100ng/ul)用量1μl，引物F试剂(10μM)用量1μl，引物R试剂(10μM)用量1μl，易错PCR反应mix试剂用量15μl，10
×
MnCl2试剂用量3μl，ddH2O试剂用量Upto30μl。
[0022]进一步的，所述步骤S4中易错PCR扩增过程及条件为：94℃预变性3min，94℃变性30sec、50℃退火30sec和72℃延伸1min/kb为40个循环。
[0023]进一步的，所述步骤S7中载体为pTOPO载体进行连接，DH5α化学细胞感受态，转化采用热激转化方法。
[0024]进一步的，所述步骤S8中阳性克隆筛选20个，菌液送测序取200ul。
[0025]3.有益效果
[0026]相比于现有技术，本专利技术的优点在于：
[0027](1)本方案可以实现通过高突变率的易错PCR技术对基因文库的构建、快速获得优质基因、对特定基因进行定向进化。
[0028](2)本方案通过配制易错PCR反应mix，在针对不同的基因设计引物，且片段大小不同，随后建立易错PCR反应体系，将配制好的易错PCR反应体系放入PCR扩增仪中进行易错PCR扩增，利用琼脂糖凝胶电泳验证易错PCR产物，在胶回收得到纯化的易错PCR产物，从而进行连接、转化，阳性克隆筛选，菌液送测序，不仅操作简便，同时得到的PCR产物产量高、变异水平高。
附图说明
[0029]图1为本专利技术的易错PCR反应体系表；
[0030]图2为本专利技术的易错PCR扩增程序表；
[0031]图3为本专利技术的筛选突变个数表。
具体实施方式
[0032]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述；显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例，基于
本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0033]实施例1：
[0034]请参阅图1
‑
3，一种高突变率的易错PCR技术的建立与应用，包括以下步骤：
[0035]S1.配制易错PCR反应mix，以及10
×
氯化锰溶液；
[0036]S2.针对两个基因分别设计引物；
[0037]S3.建立易错PCR反应体系；
[0038]S4.将配制好的易错PCR反应体系放入PCR扩增仪中进行易错P本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种高突变率的易错PCR技术的建立与应用，其特征在于：包括以下步骤：S1.配制易错PCR反应mix，以及10X氯化锰溶液；S2.针对两个基因分别设计引物；S3.建立易错PCR反应体系；S4.将配制好的易错PCR反应体系放入PCR扩增仪中进行易错PCR扩增；S5.扩增得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳，全部上样，验证条带大小是否正确。S6.琼脂糖凝胶回收得到纯化的易错PCR产物；S7.进行载体连接、转化；S8.筛选阳性克隆，取菌液送测序。2.根据权利要求1所述的一种高突变率的易错PCR技术的建立与应用，其特征在于：所述步骤S1中易错PCR反应mix分别包括Taq DNA聚合酶：200
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500U/ml，dATP(100Mm)：3
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8μl/ml；dTTP(100Mm)：15
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20μl/ml；dGTP(100Mm)：3
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8μl/ml；dCTP(100Mm)：15
‑
20μl/ml；氯化镁：5
‑
10mM；氯化钾：200
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500mM；Tris：40
‑
100mM，所述10
×
氯化锰...
【专利技术属性】
技术研发人员：蔡文博，智庆文，
申请(专利权)人：江苏晨逸京泽生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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