一种RhD血型基因RHD634G＞A等位基因及检测制造技术

本发明专利技术公开了一种RhD血型基因RHD634G>A等位基因及其检测。该发明专利技术提供RhD血型基因RHD634G>A等位基因位点g.25301093G>A突变。采用特异性引物‑PCR技术设计出针对基因突变的引物序列，通过基因扩增方法对包含突变基因的区域专门针对RHD634G>A等位基因进行检测。

【技术实现步骤摘要】
一种RhD血型基因RHD634G＞A等位基因及检测
本专利技术涉及分子生物学
，尤其涉及一种RhD血型基因RHD634G＞A等位基因及检测。
技术介绍
Rh血型是人类红细胞血型系统中最为复杂、最具多态性的系统，也是引起临床输血反应和严重新生儿溶血病的主要红细胞血型。目前已发现50多种Rh血型抗原，其中RhD抗原具有很强的免疫原性，是由RHD基因编码产生，是血型研究的重点。临床上根据红细胞膜表面是否检测到D抗原，将Rh血型抗原分为RhD阳性和RhD阴性两大类。目前，Rh血型D抗原的常规检测方法是采用血清学盐水法和间接抗人球蛋白试验以及吸收放散试验进行鉴定。但是血清学技术存在一定的局限性。由于疾病或其他因素的影响，某些个体的红细胞在血清学定型时结果难以判定；慢性长期输血患者血清学结果有时呈现“混合视野”的现象；当无法获得样本的红细胞或红细胞样本不足时，像胎儿血型鉴定、法医鉴定遗留物等，血清学检测也不能获得正确结果。用免疫血清学的方法对RhD血型的检测主要依赖于抗-D抗体的特异性和抗原表达量。目前随着分子生物技术的发展，RhD突变体逐年增加，其抗原表达量和基因突变位点各有差异。这些基因突变体的检测主要通过分子生物学方法确定Rh血型D抗原基因型，不仅在弥补血清学技术的不足上具有重要的临床实用意义，而且还具有广泛的科研应用价值。所以有必要提供一种RhD血型基因RHD634G＞A等位基因及用于其检测的特异性引物。
技术实现思路
专利技术目的：为了克服现有技术中存在的不足，本专利技术提供一种RhD血型基因RHD634G＞A等位基因及用于其检测的特异性引物。技术方案：为实现上述目的，本专利技术的一种RhD血型基因RHD634G>A等位基因，该基因RHD634G>A等位基因位点g.25301093G>A突变；所述g.25301093G>A突变是指突变位点在SEQIDNO:1序列的第219位碱基G突变为A；其突变基因DNA序列如SEQIDNO：2所示。一种用于检测RHD634G>A等位基因的特异性引物，该特异性引物的上游引物序列如SEQIDNO:3所示，下游引物序列如SEQIDNO:4所示，用于检测RHD634G>A等位基因。本专利技术的检测方法是利用人类RhD血型不同等位基因特异性序列位点的改变，设计出针对性引物序列进行聚合酶链反应来完成的。RhD血型基因RHD634G>A等位基因位点g.25301093G>A突变。该突变发生于第1号染色体的25301093位置，该基因在NCBl参考数据库GRCh38.p13中的编号为NC_000001.11(25272393-25330445)。这里列出在该数据库中包含有本位点野生型的部分碱基序列供参考，如SEQIDNO：1所示，其突变位点在SEQIDNO:1序列的第219位由碱基G突变为A。RHD基因突变的相对应序列如SEQIDNO：2所示。SEQIDNO:1CCAAGGACTATCAGGGCTTGCCCCGGGCAGAGGATGCCGACACTCACTGCTCTTACTGGGTTTTATTGCAGACAGACTACCACATGAACATGATGCACATCTACGTGTTCGCAGCCTATTTTGGGCTGTCTGTGGCCTGGTGCCTGCCAAAGCCTCTACCCGAGGGAACGGAGGATAAAGATCAGACAGCAACGATACCCAGTTTGTCTGCCATGCTGGGTAAGGACAAGGTGGGGTGAGTGGTCTCCTACTTGGGCTGAGCAGAATGGCTCAGAAAAGGCTCTGGCTGAAAAAATCTCCCTCCTTTACCAAGTTCCCCTGGGTGTCTGAAGCCCTTCCATCATGATTCATTTCTTTGAGTAGTGTTTGCTAAATTCATACSEQIDNO:2CCAAGGACTATCAGGGCTTGCCCCGGGCAGAGGATGCCGACACTCACTGCTCTTACTGGGTTTTATTGCAGACAGACTACCACATGAACATGATGCACATCTACGTGTTCGCAGCCTATTTTGGGCTGTCTGTGGCCTGGTGCCTGCCAAAGCCTCTACCCGAGGGAACGGAGGATAAAGATCAGACAGCAACGATACCCAGTTTGTCTGCCATGCTGAGTAAGGACAAGGTGGGGTGAGTGGTCTCCTACTTGGGCTGAGCAGAATGGCTCAGAAAAGGCTCTGGCTGAAAAAATCTCCCTCCTTTACCAAGTTCCCCTGGGTGTCTGAAGCCCTTCCATCATGATTCATTTCTTTGAGTAGTGTTTGCTAAATTCATAC所述RhD血型基因RHD634G>A等位基因的检测方法，通过基因扩增对包含突变基因的目标部位进行选择性地扩增，以此检测该突变基因的有无。所述检测方法如下：(1)提取待检样本中DNA；(2)以该DNA为模板，以针对RHD634G>A突变基因附近的编码区设计的PCR引物进行PCR反应，得到PCR反应产物；(3)测出PCR反应产物的核苷酸序列组成；(4)将核苷酸序列与RHD野生型基因的序列进行比较，确定是否有634G→A突变。所述PCR反应产物的核苷酸序列组成可以将PCR反应产物通过测序仪进行测序。所述RhD血型基因RHD634G>A等位基因的检测。具体步骤如下：(1)引物设计：根据美国国家生物信息中心(NCBI)GenBank记录的RHD基因(序列号：NC_000001.11)，通过Oligo6.0引物软件设计引物，最终确定1对特异性寡核苷酸引物序列,上游引物序列如表1中SEQIDNO:3所示；下游引物序列如SEQIDNO:4所示，扩增产物片段长度为174bp。表1.RHD993C>T等位基因检测引物序列及反应特异性注：*寡核苷酸引物序列所涉及的外显子碱基序列的位置是指由ATG起始编码子开始的10个外显子整个排列顺序；所涉及的内含子碱基序列的位置是指每个内含子单个排列顺序。(2)RHD634G>A等位基因增扩：反应体系总体积50μL；其中含PCR5×缓冲液10μL，DNA模板5.0μL，1U/μL的Taq聚合酶1.0μL，MgCl2终浓度为2.0mmol/L，dNTP终浓度为200nmol/L，特异性正向引物和反向引物的终浓度均为200nmol/L；加消毒双蒸水至反应体系总体积50μL；将上述反应体系在PCR仪中反应。反应条件：95℃预变性5min，然后依次94℃变性30s，接着62℃退火35s，72℃延伸1min，共35个循环。(3)RHD634G>A等位基因检测：用琼脂糖凝胶对将步骤(2)所得的增扩产物进行电泳，以检测其是否有目的片段。有益效果：本专利技术采用分子生物学方法进行基因水平的检测，可以本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种RhD血型基因RHD634G>A等位基因，其特征在于：该基因RHD634G>A等位基因位点g.25301093G>A突变；所述g.25301093G>A突变是指突变位点在SEQ ID NO:1序列的第219位碱基G突变为A；其突变基因DNA序列如SEQ ID NO：2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种RhD血型基因RHD634G>A等位基因，其特征在于：该基因RHD634G>A等位基因位点g.25301093G>A突变；所述g.25301093G>A突变是指突变位点在SEQIDNO:1序列的第219位碱基G突变为A；其突变基因D...

【专利技术属性】
技术研发人员：王学东，王保龙，邵超鹏，王玥苹，顾娟，马静，姬艳丽，
申请(专利权)人：无锡市第五人民医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32