USP10在肝脏缺血再灌注损伤中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种USP10在肝脏缺血再灌注损伤中的应用。本发明专利技术选择USP10基因敲除小鼠和C57BL/6野生型小鼠为实验对象，分别构建小鼠肝脏缺血再灌注损伤模型，研究USP10在肝脏缺血再灌注损伤中的功能，发现了USP10基因在肝脏缺血再灌注损伤中的新功能，USP10过表达可通过抑制炎症和细胞凋亡减轻肝脏缺血再灌注损伤，因此可将USP10应用于制备预防/治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物中，为肝脏缺血再灌注损伤提供新的药物靶点。

【技术实现步骤摘要】
USP10在肝脏缺血再灌注损伤中的应用
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及USP10在肝脏缺血再灌注损伤中的应用。
技术介绍
肝脏缺血再灌注(ischemia-reperfusioninjury，I/R)损伤是肝移植过程中常见的病理生理过程。I/R损伤常导致肝功能不全甚至不可逆性肝损伤，这也是肝移植急、慢性排斥反应的主要原因。由于边缘供肝对缺血损伤非常敏感，I/R损伤也限制了边缘供肝的使用。在肝脏缺血期间，危险相关分子模式(DAMP)激活库普弗细胞、中性粒细胞和其他免疫细胞，然后释放炎症细胞因子和趋化因子。一系列的炎症反应被激活，导致肝细胞进一步凋亡和坏死。因此，炎症反应和细胞凋亡是肝I/R损伤的关键步骤，寻找炎症反应和细胞凋亡的调控机制对防治I/R损伤具有重要意义。泛素特异性蛋白酶10(USP10)是半胱氨酸蛋白酶泛素特异性蛋白酶家族的成员，具有从泛素结合蛋白底物中切割泛素的特性。USP10参与环境应激反应、肿瘤生长、炎症反应和细胞代谢等过程。在非酒精性脂肪肝(NAFLD)模型中，USP10通过与Sirt6相互作用并抑制其泛素化和降解来抑制肝脏脂肪变性、胰岛素抵抗和炎症反应，抑制USP10还可取消Mirt2(长非编码RNA心肌梗死相关转录物2)过度表达诱导的肝细胞葡萄糖和脂肪生成的抑制。siRNA介导的USP10敲除和USP10抑制剂的应用有效地减轻了姜黄素诱导的伴有线粒体和内质网扩张的程序性细胞死亡。另外，p53的稳定性和精确定位对肿瘤抑制功能至关重要，而USP10作为p53在DNA损伤反应和肿瘤发生中的新的调控因子，可以调控包括肝细胞癌在内的多种肿瘤的发展。然而，USP10在肝脏缺血再灌注中的病理生理学作用尚未得到充分证实。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种USP10在肝脏缺血再灌注损伤中的应用，确定USP10基因的表达与肝脏缺血再灌注损伤之间的关系，揭示USP10在肝脏缺血再灌注损伤中的新功能。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术选择USP10基因敲除小鼠(USP10-HZ)和C57BL/6野生型小鼠(WT)为实验对象，分别构建小鼠肝脏缺血再灌注损伤模型，然后进行原代肝细胞的分离培养和肝细胞体外缺氧/复氧(H/R)模型的构建；通过构建腺病毒介导的USP10高表达小鼠、腺病毒介导的USP10高表达原代肝细胞、显性阴性TAK1腺病毒(dn-TAK1)及原代肝细胞的感染，研究USP10在肝脏缺血再灌注损伤中的功能。通过肝功能测定、HE染色、TUNEL染色、免疫组化、免疫荧光、WB、qRT-PCR、统计分析等检测分析，结果显示：1.与WT组相比，USP10-HZ组的肝脏坏死面积显著增加，USP10基因敲除加重了肝脏缺血再灌注损伤和肝脏炎症反应，促进肝脏缺血再灌注损伤过程中的细胞凋亡。2.USP10过表达可通过抑制炎症反应和细胞凋亡从而减轻肝脏缺血再灌注损伤，并从阳性和阴性两个方面抑制H/R处理后肝细胞的炎症和凋亡。3.TAK1介导了USP10在肝脏缺血再灌注损伤中的保护作用，TAK1抑制可消除USP10敲低对炎症和肝细胞凋亡的影响。本专利技术提供一种USP10在制备预防/治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物中的应用。按上述方案，所述药物为能够促进USP10表达的药物。本专利技术的有益效果为：本专利技术发现了USP10基因在肝脏缺血再灌注损伤中的新功能，USP10过表达可通过抑制炎症和细胞凋亡减轻肝脏缺血再灌注损伤，因此可将USP10应用于筛选或制备预防/治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物中，为肝脏缺血再灌注损伤提供新的药物靶点。附图说明图1为在I/R模型中USP10基因敲除后WT小鼠肝脏中USP10表达结果图；其中：(A)为肝I/R损伤后在固定时间点WT小鼠肝脏中USP10mRNA表达结果图(每组n＝6)；(B)为肝I/R损伤后在固定时间点WT小鼠肝脏中USP10蛋白表达结果图(每组n＝3)；(C)和(D)分别为原代肝细胞在H/R后固定时间点的USP10mRNA和蛋白质表达结果图；(E)为I/R后的USP10-HZ小鼠和WT小鼠以及假手术组(每组n＝7)6小时和24小时的血清ALT和AST水平；(F)为来自I/R后USP10-HZ小鼠和WT小鼠和假手术组小鼠(每组n＝7)6小时和24小时假手术组小鼠(每组n＝7)的缺血肝叶中H&E染色坏死区域的代表性图像；所示结果代表了三个独立的实验，GAPDH作为内参。对于统计分析，A-D采用单因素方差分析，E和F采用两独立样本T检验。N.s不显著，*P<0.05，**P<0.01。图2为USP10基因敲除后肝脏I/R过程中的炎症反应结果图；其中：(A)和(B)分别为I/R损伤后的USP10-HZ小鼠和WT小鼠及假手术组(每组n＝4)6小时(A)和24小时(B)促炎因子(TNF-α、IL-6、IL-1β和Ccl2)的mRNA水平结果图；(C)为再灌注后6小时USP10-HZ小鼠和WT小鼠肝脏及假手术组(每组n＝3)的CD11b和Ly6G免疫荧光染色图；(D)为I/R损伤后6小时，USP10-HZ小鼠和WT小鼠(每组n＝3)肝脏中NF-κB信号成分的蛋白表达水平；GAPDH作为内参，对于统计分析，A采用单因素方差分析，B-D采用两独立样本T检验。N.s不显著，*P<0.05，**P<0.01。图3为USP10基因敲除促进肝I/R细胞凋亡；其中：(A)和(B)分别为USP10基因敲除后肝脏缺血再灌注后6小时(A)和24小时(B)的USP10-HZ小鼠和WT小鼠及假手术组(每组n＝4)肝脏中细胞死亡相关基因(Bad、Bax和Bcl2)的mRNA水平结果图；(C)为再灌注后6小时，在USP10-HZ小鼠和WT小鼠及假手术组(每组n＝3)的肝叶中有代表性的TUNEL染色图；(D)为再灌注后6小时，各组USP10-HZ小鼠和WT小鼠(每组n＝3)肝脏细胞死亡相关基因(Bax和Bcl2)的蛋白质水平图；(E)为再灌注后6h，USP10-HZ小鼠和WT小鼠(每组n＝4)肝叶的典型免疫组织化学染色图；(F)为再灌注后6小时，USP10-HZ小鼠和WT小鼠(每组n＝3)肝叶中C-Caspase3蛋白水平图；GAPDH作为内参，统计采用了方差分析法(A-B)。N.s不显著，*P<0.05；**P<0.01。图4为USP10过表达对I/R模型小鼠肝损伤的影响结果图；其中：(A)为缺血后6小时Ad-GFP小鼠和Ad-USP10小鼠及假手术组小鼠(每组n＝6)缺血肝叶H&E染色坏死区域的代表性图像；(B)I/R后6小时Ad-GFP和Ad-USP10小鼠及假手术组(每组n＝8)的血清ALT和AST水平；(C)I/R损伤后6小时Ad-GFP和Ad-USP10小鼠(每组n＝4)检测促炎因子(TNF-α、I本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.USP10在制备预防/治疗肝缺血再灌注损伤的药物中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.USP10在制备预防/治疗肝缺血再灌注损伤的药物中的应用。

【专利技术属性】
技术研发人员：周江桥，邱涛，王天宇，陈忠宝，马枭雄，张龙，邹寄林，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42