circ-RNF13-TRIM41-p53复合体作为靶位点检测制剂的应用制造技术

本发明专利技术公开了circ‑RNF13‑TRIM41‑p53复合体作为靶位点检测制剂在制备鼻咽癌紫杉醇增敏药物中的应用。本发明专利技术研究表明，鼻咽癌紫杉醇耐药细胞株中circ‑RNF13可与泛素连接酶TRIM41和p53蛋白结合形成复合体调控鼻咽癌紫杉醇敏感性。机制研究表明，p53蛋白主要结合在circ‑RNF13的1‑176 nt区域上，TRIM41蛋白主要结合在circ‑RNF13的301‑425 nt区域上，阻断circ‑RNF13的相关区域可使p53蛋白与TRIM41蛋白的结合能力减弱，减弱了TRIM41对p53的泛素化降解，进而导致鼻咽癌细胞对紫杉醇的敏感性增加。因此，circ‑RNF13‑TRIM41‑p53复合体可在制备鼻咽癌紫杉醇增敏药物中作为靶位点。

【技术实现步骤摘要】
circ-RNF13-TRIM41-p53复合体作为靶位点检测制剂的应用
本专利技术属于生物医药
，具体涉及circ-RNF13-TRIM41-p53复合体作为靶位点检测制剂在制备鼻咽癌紫杉醇增敏药物中的应用。
技术介绍
鼻咽癌（Nasopheryngealcancer,NPC）是一种高度侵袭性的鳞状细胞癌，常见于东亚（尤其是我国南部）、东南亚以及北非地区。除遗传和环境因素外，EB病毒（Epstein-Barrvirus,EBV）在鼻咽癌的发生发展中也起着重要的作用。由于鼻咽部解剖结构复杂，且鼻咽癌细胞对放射线高度敏感，因此放射治疗是鼻咽癌的主要治疗方法。但是，由于鼻咽癌起病隐匿，约有60%~70%的患者就诊时已处于III期或IV期。最新的NCCN指南（2020.V1）指出，对于非早期鼻咽癌患者，同步放化疗或是辅助化疗是主要的治疗手段。紫杉醇是鼻咽癌常用的化疗药物，无论是联合治疗还是单药化疗，都在临床中广泛使用[3]。然而，部分患者在治疗过程中对紫杉醇原发或获得性耐药从而导致预后欠佳，因此，探讨鼻咽癌紫杉醇耐药新机制具有重大的临床意义。环状RNA（CircularRNA，circRNA）是非编码RNA的一种特殊成员，在细胞分化和代谢等生命活动中发挥非常重要的作用。深入探讨circRNA的相关功能，极有可能挖掘疾病诊断的新型标志物及潜在的药物靶点，具有非常重要的潜在临床应用价值。研究表明circRNA除了可海绵吸附miRNA的作用外，还能与蛋白质结合调节蛋白质的细胞定位、功能和稳定性，并影响蛋白质-蛋白质和蛋白质-DNA的相互作用。例如，circ-Amotl1可以与PDK1和AKT1相互作用，促进它们的核易位，并促进AKT1的磷酸化；circYAP可以通过结合翻译起始蛋白eIF4G和PABP，抑制母基因YAP的mRNA翻译起始，调控YAP蛋白的表达量；circ1662可与YAP1结合促进其入核，进而抑制SMAD3和E-Cadherin的活性，提高结肠癌细胞的迁移侵袭能力。我们前期以鼻咽癌CNE-1亲本株/紫杉醇耐药株与HNE-2亲本株/紫杉醇耐药株为研究对象，行circRNA芯片筛查，结果发现hsa_circ_0067717的差异表达最明显（由RNF13的2-5外显子形成，我们将其称为circ-RNF13。我们通过体内外实验已证实circ-RNF13可通过结合泛素连接酶TRIM41蛋白和p53蛋白，并介导p53的泛素化降解，进而可促进鼻咽癌细胞紫杉醇。但是circ-RNF13上TRIM41蛋白和p53蛋白的结合区域是否发挥了促进鼻咽癌细胞对紫杉醇耐药的作用仍需进一步深入探究。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种可以用于制备鼻咽癌紫杉醇增敏药物的新靶点。在本研究中，我们首次发现在鼻咽癌紫杉醇耐药细胞中circ-RNF13可与p53蛋白、TRIM41蛋白结合形成circ-RNF13-TRIM41-p53复合体，增强TRIM41对p53的泛素化降解，并降低p53蛋白的稳定性，从而导致鼻咽癌细胞中紫杉醇的化学耐药性。本研究促进了我们对circRNA与蛋白结合机制的理解，并提供了抑制鼻咽癌紫杉醇耐药的潜在治疗新靶点。本专利技术提供了circ-RNF13-TRIM41-p53复合体作为靶位点检测制剂在制备治疗鼻咽癌紫杉醇增敏药物中的应用，所述circ-RNF13-TRIM41-p53复合体是p53蛋白结合在circ-RNF13的1-176nt区域上，TRIM41蛋白结合在circ-RNF13的301-425nt区域上所形成的复合体。本专利技术提供了circ-RNF13-TRIM41-p53复合体作为靶位点检测制剂在制备治疗鼻咽癌紫杉醇敏感性分子标志物中的应用。本专利技术还提供了circ-RNF13的1-176nt和301-425nt区域的阻断制剂在制备治疗鼻咽癌紫杉醇敏感性分子标志物中的应用。我们预测发现circ-RNF13上TRIM41蛋白和p53蛋白具有相似的高得分结合区域：301-376nt，125-176nt和250-301nt区域，针对这三个区域设计了circ-RNF13全长探针、circ-RNF13反义探针和4种不同的circ-RNF13截短探针，行RNApulldown实验。结果表明在circ-RNF13-p53-TRIM41复合体中p53蛋白主要结合在circ-RNF13的1-176nt区域，而TRIM41蛋白主要结合circ-RNF13的301-425nt区域。为进一步确证Circ-RNF13与p53蛋白及TRIM41蛋白具体结合区域，我们利用未标记反义寡核苷酸探针竞争性的封闭circ-RNF13上目的蛋白的结合位点，设计了阻断p53结合位点的寡核苷酸（block-p53）——circ-RNF13的1-176nt区域的反向互补序列，阻断TRIM41结合位点的寡核苷酸（block-p53）——circ-RNF13的301-425nt区域的反向互补序列，行RNApulldown实验。结果表明Circ-RNF13中p53蛋白和TRIM41蛋白的主要结合区域的阻断有效地降低了TRIM41蛋白与p53蛋白的结合，抑制了p53蛋白泛素化降解，从而使p53蛋白表达水平上升。我们进一步行MTT实验、EdU增殖检测、细胞侵袭实验、细胞划痕修复实验和细胞凋亡实验，结果表明block-p53或block-TRIM41可有效逆转过表达circ-RNF13所导致的鼻咽癌紫杉醇耐药。总之，本专利技术首次发现circ-RNF13-TRIM41-p53复合体的存在促进了鼻咽癌细胞紫杉醇耐药，阻断circ-RNF13中p53蛋白和TRIM41蛋白的主要结合区域，可减弱TRIM41蛋白与p53蛋白的结合，减缓p53蛋白泛素化降解，进而逆转circ-RNF13所导致的鼻咽癌紫杉醇耐药。circ-RNF13-TRIM41-p53复合体可在制备鼻咽癌紫杉醇增敏药中作为靶位点，也是临床上预测鼻咽癌患者紫杉醇药物敏感性的的分子标志物，可能是一种新的改善鼻咽癌患者治疗和生存的策略。附图说明图1：circ-RNF13可以与TRIM41蛋白和p53蛋白结合。（a）RIP实验结合银染检测结果显示circ-RNF13可与TRIM41蛋白和p53蛋白结合。（b）RIP实验表明，与对照组相比，高表达的circ-RNF13使得TRIM41蛋白和p53蛋白都沉淀了更多circ-RNF13。（c）RNApulldown实验表明过表达circ-RNF13可以沉淀更多的TRIM41和p53。（d）当过表达TRIM41或敲低TRIM41时，RIP实验检测circ-RNF13与p53的结合情况。IgG用作阴性对照。Bars表示标准差；*P<0.05，**P<0.01。图2：circ-RNF13与TRIM41蛋白和p53蛋白的结合区域。（a）RPIseq网站预测显示TRIM41蛋白和P53蛋白与circ-RNF13具有较高的结合评分。（b）catRAPID网站显示出TRIM41、p53蛋白可能结合circ-R本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.circ-RNF13-TRIM41-p53复合体作为靶位点检测制剂在制备治疗鼻咽癌紫杉醇增敏药物中的应用，所述circ-RNF13-TRIM41-p53复合体是p53蛋白结合在circ-RNF13的1-176nt区域上，TRIM41蛋白结合在circ-RNF13的301-425 nt区域上所形成的复合体。/n

【技术特征摘要】
1.circ-RNF13-TRIM41-p53复合体作为靶位点检测制剂在制备治疗鼻咽癌紫杉醇增敏药物中的应用，所述circ-RNF13-TRIM41-p53复合体是p53蛋白结合在circ-RNF13的1-176nt区域上，TRIM41蛋白结合在circ-RNF13的301-425nt区域上所形成的复合体。


2.circ-RNF13-TRIM41-p53复合体作为靶位点检...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹科，王占旺，程雅新，何东，陈兴宇，龚恋，陈爱艳，
申请(专利权)人：中南大学湘雅三医院，
类型：发明
国别省市：湖南;43